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埼玉医科大学雑誌 第28巻第3号別頁 (2001年7月)　T43-T49頁　(C) 2001 The Medical Society of Saitama Medical School

Thesis

幹細胞傷害からみた萎縮性胃炎の発生機序についての免疫組織化学的研究
−腺管分離法・共焦点レーザー顕微鏡による解析−

藤澤　亨

埼玉医科大学第二病理学教室
（指導：高濱　素秀教授）
医学博士　乙第741号　平成13年2月23日（埼玉医科大学）

　Helicobacter pylori（以下，H.pylori）の発見¹⁾以来，その感染が胃粘膜における炎症反応の主たる原因となっていることが明かとなり，それまで原因不明とされていた慢性胃炎のほとんどがH.pyloriに密接に関連する病態であることがわかってきた²⁾．また，胃癌などの腫瘍性病変は著明な低酸状態を起した萎縮性胃炎を発生母地としていることが多い^3,4)．慢性胃炎は，表層性胃炎から固有胃腺の萎縮を呈する萎縮性胃炎へと進展してゆくことが知られている^5-7)．萎縮性胃炎は，その発生と進展に多くの因子が関与するmultifactorial diseaseであると考えられているが⁸⁾，H.pylori感染により，なぜ固有胃腺の萎縮が起るのか，また除菌により一旦発生した固有胃腺の萎縮が回復するか⁹⁾否か¹⁰⁾，などについても議論がされている．萎縮性胃炎の発生機序や予後を解析するにあたり，日々消耗と再生を繰り返す胃粘膜上皮成分の実態を知ることは意義深いことと思われる．その目的のためには組織学的解析は不可欠であるが，厚さが5 μｍの組織切片の観察では，固有胃腺のランダムな断面の観察しか出来ず，胃腺の3次元構造の情報を得ることは不可能である．そこで今回の研究では，特に腺頸部増殖帯を中心とした細胞動態の解析を目的として，内視鏡で採取した患者胃粘膜から胃腺管を単離して免疫染色を行い，共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて胃腺管を立体的に観察することを試みた．細胞動態の把握のためには，幹細胞のマーカーとしてbcl-2，増殖細胞のマーカーとしてはKi-67を選び，免疫2重染色を行い，胃腺管構成細胞の源となる幹細胞とそれから分化する新生細胞のバランスから腺管の再生や萎縮の実態を探った．

材料：（1）胃粘膜は，1999年〜2000年に本庄総合病院内視鏡科（埼玉県本庄市）で，上部消化管内視鏡検査を受けた患者のうち，本研究の主旨を理解し同意を得たH.pylori感染性萎縮性胃炎患者10名より採取された胃粘膜生検材料を使用した．生検材料は胃前庭部大彎側および胃体中部大彎側の計2ヵ所より採取した．平均年齢は55.1歳（36歳〜72歳）で，男女比は3：2であった．（2）大腸粘膜は，埼玉医科大学第二外科学教室にて施行されたS状結腸癌部分切除材料1例から，非癌部の生検体約1 cm×1 cmを採取し使用した．
腺管分離法：胃腺管および大腸腺管の分離は，BjerknesとChengの原法¹¹⁾を改変した方法¹²⁾に基づいて施行した．採取された胃生検材料および大腸外科材料を直ちに腺管分離液，すなわちCa，Mgを含まないHanks' balanced salt solution＋30 mMのEDTA（pH6.6）の中に入れ，37 ℃で1時間の保存の後，マイクロピペットにより数回吸引を繰り返し腺管を粘膜固有層から分離した．6000 rpmで10秒間遠心沈殿後，沈渣を4 ℃の腺管分離液で洗浄し，0.5%パラフォルムアルデヒドと15%（v/v）飽和ピクリン酸水溶液を含む0.1 Mのリン酸緩衝液（pH7.0）中で4 ℃，24時間固定した．固定後，同条件で遠心沈殿して沈渣を0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄し，同緩衝液に24時間浸漬後，以下の蛍光抗体法による免疫染色を施行した．
蛍光抗体2重染色：固定された分離腺管を，tween20を0.1%含む0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（以下，PBS）で洗浄後，10%の正常ヤギ血清（以下，NGS）中に室温で1時間おいて非特異反応をブロッキングし，一次抗体と反応させた．一次抗体には，抗ヒトbcl-2・マウスモノクローナル抗体（DAKO, Denmark）をNGSで50倍に希釈したものを室温，2時間反応させた．PBSで洗浄後，二次抗体はビオチン化抗マウスIgGヤギ血清（DAKO, Denmark）をNGSで200倍に希釈して室温で1時間反応させ，さらにlabelled streptavidin biotin（LSAB）法としてFITC標識Streptavidin（DAKO, Denmark）をPBSで100倍に希釈し，室温で1時間遮光して反応させた．PBSで洗浄後，2重染色に移った．核内抗原賦活のため，クエン酸緩衝液（10 mMsodium citrate buffer，pH6.0）に検体を浸漬させ95 ℃で30分間の温浴を施し，20分間室温で放置した後PBSで洗浄，腺管のcell cycle上のG₁・Ｓ・G₂・M期の核を同定する目的で，抗ヒトKi-67抗原・ウサギポリクローナル抗体（DAKO, Denmark）をNGSで100倍に希釈したものを室温で2時間遮光して反応させた．PBSで洗浄後，抗Ki-67抗体に対する二次抗体にはTRITC標識抗ウサギIgGヤギ血清（Supertechs, USA）をNGSで10倍に希釈したものを室温で1時間遮光して反応させた．核染色はTO-PRO-3（Molecular Probes, Oregon, USA）を10 μg/mlとなるようPBSで希釈し，室温で10分間，遮光して反応させた．反応の終わった分離腺管をPBSで洗浄後，50 mg/mlの1,4-Diazabicyclo-[2,2,2]octane（DABCO）と30%のグリセリン（Merck，東京）を含む0.05 Mトリス塩酸緩衝食塩水（TBS, pH8.0）中に分散した．以上の反応は全行程1.5 mlのマイクロチューブ内で行なった．
共焦点レーザー走査顕微鏡による観察：25×55 mmのカバーグラス（武藤化学，東京）上に分離腺管検体をのせ，倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡 Radiance 2000（Bio-Rad，東京）で各抗原の局在について観察し，画像はレーザー顕微鏡制御用ソフトウエアLaser Sharp 2000（Bio-Rad，東京）を用いて取りこんだ．FITC（励起極大：494 nm，蛍光極大：518 nm）はアルゴンイオンレーザー（488 nm）で励起し，発生する緑色蛍光を透過波長幅515±15 nmのバンドパスフィルターで選択して検出，TRITC（励起極大：544 nm，蛍光極大：572 nm）は，ヘリウム-ネオンレーザー（543 nm）で励起し，発生する赤橙色蛍光を透過波長幅590±35 nmのバンドパスフィルターで選択して検出，TOPRO3（励起極大：642nm，蛍光極大：660 nm）は，アルゴンクリプトンレーザー（647nm）で励起し，発生する赤色蛍光を透過波長660 nm以上のロングパスフィルターで選択して検出した．コンピューターに取り込んだ画像上，FITCは緑黄色，TRITCは赤色，TO-PRO-3は青色の擬似カラーを用いて表示した．分離腺管は直径約60〜80 μmの大きさであるため，その3次元構造を構築するためにXY（Z-Series）collection programでZ軸方向に1 em間隔で断層像を取り込み，Projection programで重ね合わせて立体像を構築した．またX-Z（vertical section) collection programで断面像を構築した．

�@光顕像：（1）大腸分離腺管；大腸腺管は単腺管であり，胃腺管に比べて分離が容易であった．また染色行程によるartifactも比較的少なかった．一部に粘膜固有層の線維にからまったまま複数の大腸腺管が群れをなして固定されているものもあった．（2）胃分離腺管；幽門腺では2分岐型の腺管として認められることが多かったが，稀に3分岐する腺管も認められた．それに比べて胃底腺では単腺管が多く，2分岐型の腺管は少なかった．また同症例・同検体中の分離腺管でありながら，各固有胃腺ごとに形態学的な萎縮の程度にばらつきがあり，腸上皮化生を伴うものも混在していた．特に粘膜固有層の線維成分を少なからず伴った腺管では，観察時には腺頸部から固有胃腺が引きちぎれていたものも多かった．
�A蛍光抗体2重染色像：（1）大腸分離腺管；bcl-2（緑黄色）の発現が，陰窩底部尖端の3〜4個の細胞の胞体に強く認められた．Ki-67（赤色）の発現は，陰窩下部1/3の領域の細胞核に密に強く認められた．さらには一部，陰窩底部の細胞核にも散在性に発現が認められた．（2）胃幽門腺分離腺管；bcl-2（緑黄色）の発現は，腺頸部から腺底部に至る固有胃腺細胞の胞体に，びまん性，あるいは散在性に認められた．Ki-67の発現は，腺窩上皮細胞の核に連続的に認められ，また腺頸部から腺底部にかけて散在性に認められた．
�B共焦点レーザー走査顕微鏡による連続断層像および三次元再構築像：（1）大腸分離腺管；レーザー励起光を照射することにより得られた連続断層像を取り込み，重ね合わせた結果，細胞質にbcl-2を発現すると同時に，核にKi-67を発現する細胞が，陰窩底部尖端にあるbcl-2単独陽性細胞群の両側に隣接して1〜2個認められた．さらにその上方にはKi-67単独陽性細胞が散在性に認められた．図1にその断層像（a）と，三次元再構築像（b）を示す．（2）胃幽門腺分離腺管：胞体にbcl-2を単独発現する細胞と，核にKi-67を単独発現する細胞およびbcl-2とKi-67の両者が発現した細胞などが散在性にあるいは群をなして，腺頸部領域を中心に認められた．

　この腺頸部におけるbcl-2単独陽性細胞，Ki-67単独陽性細胞，bcl-2・Ki-67両陽性細胞の分布には大別して4通りの像が認められた．図2にその断層像と3次元再構築像を示す．4通りの分布像とは， I .腺頸部にbcl-2単独陽性細胞の小集団があり，その上方（腺窩上皮側）および下方（固有胃腺側）にbcl-2・Ki-67両陽性細胞が並び，さらにその上方および下方にKi-67単独陽性細胞が並ぶもの（図2-a）， II .腺頸部からbcl-2・Ki-67両陽性細胞が上方に優位に分布し，続いてKi-67単独陽性細胞が分布しているもの（図2-b）， III . bcl-2・Ki-67両陽性細胞が上方および下方いずれにもほとんど認められないもの（図2-c）， IV .固有胃腺ごとにbcl-2・Ki-67両陽性細胞の分布範囲が異なるもの（図2-d），である．そして I を均等型， II を上方優位型， III を停滞型， IV を複合型，と分類した．その分布像のシェーマを図3に示す．
�C胃幽門腺分離腺管の断面像：共焦点レーザー走査顕微鏡付属のプログラムソフトを用い，腺窩上皮部，腺頸部，幽門腺腺体部の各断面像を作成した．その結果，腺窩上皮部断面像ではKi-67単独陽性細胞が散在してみられ，腺頸部断面像ではbcl-2単独陽性細胞と，bcl-2・Ki-67両陽性細胞とが，混在して認められた．幽門腺腺体部断面像ではbcl-2単独陽性細胞の散在が認められた．各断面像を図4に示す．

　胃は，飲食物や薬物などによる種々雑多な刺激にさらされるため，胃炎，特に慢性胃炎が発生することが多い．H.pyloriの発見により¹⁾，原因不明の慢性胃炎のほとんどがH.pyloriに起因する病態であることがわかってきた²⁾．慢性胃炎は，胃粘膜に炎症細胞浸潤を呈する表層性胃炎，胃固有腺萎縮を呈する萎縮性胃炎，さらには腸上皮化生を伴った化生性胃炎など広いスペクトラムを示し，長い年月を経て進展してゆくことが知られている^5-7)．萎縮性胃炎は，その発症と進展に多くの因子が関与するmultifactorial diseaseであると考えられているが⁸⁾，腺管の萎縮の発生機序ならびにH.pylori性胃炎へと進展してゆく過程においてH.pyloriを含めた多くの因子がどのように影響を及ぼしているかについては，近年，特に関心がもたれているものの不明な点が多い．萎縮性胃炎では，病理組織学的に粘膜固有層のリンパ球・形質細胞浸潤が高度になるにつれて増殖帯の延長が認められ，増殖帯内における増殖細胞出現率（Ki-67標識率）が有意に高くなるとする報告がある¹³⁾．しかし実地上は，腺窩上皮の延長像と共に幽門腺や胃底腺の固有胃腺の萎縮を認める例に遭遇することが多く，その病態は過形成性萎縮性胃炎hyperplastic atrophic gastritisと言われる．胃腺管では，消化活動に伴う上皮細胞の生理的消耗や炎症性の病的破壊などが起っており，その補充再生が腺頸部の増殖帯の適切な細胞分裂により恒常的に保たれている¹⁴⁾．腺頸部の増殖帯内には母細胞すなわち上皮幹細胞(epithelial stem cell）が存在すると信じられている^15,16)．幹細胞(stem cell）とは「多分化能を有する未分化な細胞」と定義され^17-19)，通常の状態ではその細胞分裂は強く抑制されている．しかし創傷治癒や再生に際して細胞分裂を起すが，その細胞分裂は不均等分裂で2個の性質を異にする細胞となり，一方は自己複製能（self-renewal capacity）¹⁹⁾によって元通りの幹細胞の性格をそのまま受け継いだ細胞，他方は自己複製能を欠いてある方向への分化増殖能を獲得した細胞（committed cell）²⁰⁾，あるいは前駆細胞（progenitor cell）²¹⁾となる．幹細胞は増殖能力を温存しているものの，通常状態では細胞周期上G₀期にあるとされ，免疫組織学的に増殖マーカーであるPCNA，Ki-67に陰性¹⁸⁾，幹細胞マーカーとしてbcl-2²²⁾，インテグリンβ1²³⁾，p75NGFR²⁴⁾などに陽性となる．特にbcl-2は正常胃腺頸部増殖帯の内部での弱い発現がみられ²⁵⁾，粘膜上皮再生の基点となるstem cellをapoptosisから保護しているとする報告もある^26-28) ．幹細胞は胃の他に大腸陰窩上皮²⁹⁾，子宮頸部重層扁平上皮³⁰⁾，乳腺上皮²¹⁾，などでbcl-2に陽性となるという報告がなされている．しかし抗bcl-2抗体を用いた免疫染色は，フォルマリン固定パラフィン切片に利用可能となっているにも拘らず，実際に利用してみると満足できる染色結果はなかなか得られなかった．また通常のホルマリン固定・パラフィン切片では抗原賦活のため蛋白分解酵素処理やオートクレーブなどの強い熱処理が必要であることが多く，この処理により形態を著しく損なう危険性がある．従って，本研究では，まず分離した腺管に対し0.5%のパラフォルムアルデヒドによる短時間の固定を施すことにより，bcl-2の抗原性を保持することができ，腺頸部での幹細胞の局在をより明瞭に証明することに成功した．また，腺頸部は形態的に狭小であるため，上方の腺窩上皮部および下方の腺底部との形態的繋がりが捕らえにくい上，ホルマリン固定・パラフィン包埋材料では抗原性が失活したり流出しており，確実な免疫染色結果が得られない．さらに胃幽門腺腺管は複合腺管であるため，分岐した腺管の全貌をくまなく顕微鏡観察することは，5 μｍの厚さの通常のパラフィン切片では不可能である．今回の研究では，腺管をまるごと分離したものにつき，抗Ki-67抗体および抗bcl-2抗体を用いて2重免疫染色し，これより共焦点レーザー顕微鏡で1 μｍ間隔の連続断層像を得たのち，画像を合成して腺管全体の立体像を記録する計画を立てた．
その結果，大腸分離腺管ではKi-67単独陽性細胞が陰窩の下1/3において全周性に密に分布しているのが明瞭に観察され，一部陰窩底部領域にまで散在性に分布していた．陰窩底部尖端域にはbcl-2単独陽性細胞が3〜4個群をなして局在している像が明瞭に観察された．この細胞は大腸陰窩の上皮幹細胞としての性質を備えているものと考えられている²²⁾．さらにその両側に隣接してbcl-2・Ki-67両陽性細胞が1〜2個ずつ認められ，その上方にKi-67単独陽性細胞が続いていた．大腸陰窩においては，このように陰窩底の尖端から始まる細胞序列がみられるが，それと異なり胃幽門腺では腺頸部にbcl-2単独陽性細胞が位置し，その両側にbcl-2・Ki-67両陽性細胞が認められ，続いてKi-67単独陽性細胞が分布しており，この区域が増殖帯であるとみなされた．この細胞序列にあってbcl-2単独陽性細胞は胃幽門腺の幹細胞と考えられた．
　また萎縮固有胃腺および大腸陰窩底部にbcl-2陽性細胞が認められたことは，同細胞がapoptosisに対し抑制されていることを示唆し，bcl-2およびKi-67の両者に陽性の細胞がbcl-2単独陽性細胞に隣接して観察されたが，この両陽性細胞は，上皮幹細胞が不等分裂し，分化増殖能を獲得した前駆細胞（progenitor cell）としての性質をもつものと推定された²¹⁾）（図5）．本研究で，この両陽性細胞の胃幽門腺腺頸部における分布像には大別して4型あることが判明した（図3）． I の均等型は，上方の腺窩上皮および下方の固有胃腺上皮の両方向に分化増殖能を獲得したprogenitor cellが上皮幹細胞からバランス良く産生されている像と考えられ，上皮幹細胞の多分化能がいまだ保たれていることを示唆している像と推測された．それに対し， II の上方優位型は，腺窩上皮への分化増殖能を獲得したprogenitor cellが上皮幹細胞から優位に産生されていることが示唆され，そのために腺窩上皮細胞は増加しているものの，固有胃腺細胞は減少してゆくというアンバランスが生じているものと思われ，過形成性萎縮性胃炎hyperplastic atrophic gastritisはこのような状態のものと推測される．これは上皮幹細胞の分裂能がbi-committed functionからmono-committed functionへ変化したものと考えられ，腺頸部幹細胞の分裂能に何らかの障害が生じたことを示唆するものと考えられた．さらに III の停滞型では腺頸部にほとんど両陽性細胞の分布が認められず，progenitor cellの供給源たる腺頸部幹細胞に I ， II 以上の分裂能傷害が生じていることが示唆された．すなわち萎縮性胃炎を，腺頸部の細胞動態からその重症度をgradingするならば，均等型，上方優位型，停滞型，の順にしたがって重症度は増してゆくと考えられよう．組織レベルで固有胃腺の萎縮の予後を判定する手段は無いが，腺頸部幹細胞と前駆細胞の分布からそれを判定できることになれば，ひとつの進歩である．H.pyloriの除菌による酸分泌能の回復や，萎縮固有胃腺の組織学的回復の成否，個人差，治療期間の差など報告によってまちまちであることは³¹⁾，この上皮幹細胞の傷害の程度の差に起因しているのかも知れない．腺頸部に存在するとされる上皮幹細胞が，H.pylori感染などに起因する炎症に慢性的にさらされることによりstem cell injuryが生じ，特に分裂能を含む遺伝子不安定性が生じた可能性が示唆され，このことが萎縮性胃炎の発症と進展，H.pylori除菌効果の成否に重要な役割を演じているものと推測された．

　内視鏡的に萎縮性胃炎と診断された胃生検材料から腺管を分離し，腺頸部に対して2重蛍光抗体法，共焦点レーザー顕微鏡による解析を行なった結果，腺頸部細胞増殖帯にprogenitor cellと推定されるbcl-2，Ki-67いずれにも陽性な細胞の局在が認められた．この両陽性細胞の腺頸部における分布像は均等型，上方優位型，停滞型，複合型に大別され，stem cell injuryからみて停滞型が最も萎縮性胃炎における重症型であると考えられ，除菌に対する反応も少ないものと考えられた．萎縮性胃炎の発生や進展，除菌の成否には上皮幹細胞の傷害が重要な役割を演じているものと推定された．

　稿を終えるにあたり，終始懇切な御指導，御校閲を賜りました埼玉医科大学第二病理学教室高濱素秀教授に深甚なる謝意を捧げます．また直接実験の御指導を賜りました埼玉医科大学中央研究施設形態部門大島晋講師，第二病理学教室清水禎彦講師ならびに第二病理学教室スタッフ各位に感謝致します．検体採取に御協力を賜りました本庄総合病院内視鏡科スタッフ各位，埼玉医科大学第二外科学教室スタッフ各位，第二病理学教室大学院岡村博貴先生に感謝致します．

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