埼玉医科大学雑誌

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原著

2型糖尿病状態が骨代謝に及ぼす影響の検討

須田　覚

埼玉医科大学第4内科学教室
〔平成13年7月5日受付〕

Influence of Type2 Diabetic States onto Bone Metabolism
Satoru Suda (Fourth Department of Internal Medicine, Saitama Medical School, Moroyama, Iruma-gun, Saitama 350-0495, Japan)

　　Recent epidemiological surveys have revealed that diabetes is a risk factor for bone fracture. The mechanism for this presumably relates to the various factors associated with diabetics (e.g., insulin deficiency or resistance and/or continuous hyperglycemia). We, therefore, studied the effects of high glucose and tumor necrosis factor α(TNFα) on osteoblasts and osteoclasts; TNFα has been shown to be a key factor responsible for insulin resistance. High glucose concentrations (60 mM) did not affect alkaline phosphatase (ALP) activity in mouse primary osteoblasts (OBs), whereas TNFα decreased ALP activity. Treatment of OBs with TNFαshowed an increased number of apoptotic cells. When mouse OBs and bone marrow cells were cultured in the presence of PGE₂ and 1,25(OH)₂D₃, osteoclasts (OCs) were formed under high glucose concentrations (5.6-60 mM), while TNFα inhibited OC formation in the co-cultures. When mature OCs were studied with respect to bone resorbing function, it was found that bone resorption was inhibited by exposure to high glucose (15-60 mM). TNFα also inhibited bone resorbing capacity. The effects of decreased bone resorption were, at least partly, due to the deranged actin ring formation of OCs. Although OC formation and function was modified, these agents did not influence the expression of receptor activator of nuclear factor κB ligand and osteoprotegerin in OBs nor the expression of receptor activator of nuclear factor κ B in OC progenitors. These results indicate that the functions of OBs and OCs could be modified to some extent by TNFα , together with high glucose. This study also supports our recent observation that rats with type 2 diabetes showed low turnover of bone, which resulted in deranged mechanical properties of bone.
Keywords: diabetes mellitus, insulin resistance, high glucose, tumor necrosis factor α
J Saitama Med School 2001;28:155 - 163
(Received July 5, 2001)

　緒　言

　1948年にAlbrightらが糖尿病の長期罹患患者に易骨折性が生じると報告して以来，糖尿病と骨代謝異常との関連性が検討されてきた．インスリン欠乏が特徴的である１型糖尿病では骨量減少が生じ，その結果骨折頻度が増加するという一定した見解が得られている¹⁾．一方，本邦で糖尿病の大部分を占める2型糖尿病に関しては様々な臨床報告があり，骨量が大きく変化しない以上骨折の危険因子とはならないのではないかとの指摘が多かった^2-4)．しかし糖尿病においては持続的高血糖が骨基質蛋白の糖化（グリケーション）を促し，たとえ骨の量的変化を認めなくても質的な変化が起こり，その結果骨脆弱性がもたらされる可能性がある．実際我々の検討では2型糖尿病モデル（GK）ラットでは血糖コントロール状況が易骨折性と強く相関しており，このことを支持する所見と考えられた⁵⁾．また糖尿病の骨量異常に関して報告が一定しない理由としては対象群の内因性インスリン分泌量，体型，治療方法，性，年齢，罹病期間，治療経過，合併症など様々な因子が関与していることも推測される．しかしごく最近，大規模臨床試験での結果を詳細に解析したところ，2型糖尿病も骨折の危険因子の一つであることが明らかとされ⁶⁾，糖尿病による易骨折性の病態解明に興味が持たれつつある．
2型糖尿病における高血糖状態ではインスリン抵抗性が引き起こされ，インスリン作用不足がもたらされることが病態形成に深く関与している．本病態でのインスリン抵抗性は肥満や高血糖をはじめとした代謝異常によりもたらされ，インスリン受容体のチロシンキナーゼ活性，自己リン酸化能が低下していることが示されている⁷⁾．また最近，肝臓・骨格筋といったインスリン抵抗性発現臓器に作用する因子として脂肪細胞から分泌される腫瘍壊死性因子（tumor necrosis factor α：TNFα ）が注目されている．TNFα はセリン・スレオニンキナーゼを介してインスリン受容体基質（IRS）蛋白をリン酸化し，インスリン受容体から細胞内への情報伝達を阻害したり，4型グルコース輸送担体（GLUT4）の発現を低下させることが知られている⁸⁾．このようなインスリン抵抗性がもたらされる病態は，肝臓や骨格筋といったグルコースの出納に重要な役割を果たす臓器のみでなく，骨の代謝調節機構にも影響を及ぼすことが考えられる．特に骨が内包し造血を営む骨髄組織は脂肪細胞を多く含み，加齢と共にその量が増大することが知られている．脂肪細胞はTNFα を分泌することが知られており，脂肪髄化とともに骨髄脂肪細胞が分泌するTNFα は増加すると考えられ，パラクラインのメカニズムで近傍の骨芽細胞，骨髄細胞に影響することも予想される．本研究では，糖尿病での骨代謝異常に関与すると思われる高グルコース環境とともに，2型糖尿病でのインスリン抵抗性の病態に関与するインスリン・TNFα が骨代謝の中心を担う骨芽細胞・破骨細胞の増殖や分化に対し及ぼす影響について検討した．

　材料及び方法

動物及び材料
　生後1日齢及び5週齢（雄性）ddyマウスは日本クレアより購入した．培養液は10％胎児ウシ血清（FCS，第一化学薬品），ペニシリン100 IU/ml，ストレプトマイシン100 μg/mlを含むα-minimum essential medium （α-MEM, Sigma, St. Louis, MO）を使用した．phosphate buffered saline （PBS），0.25％トリプシン-EDTA，D-グルコース，L-グルコース，マンニトール，インスリン，マウスTNFα，naphthol AS-MX phosphate，fast red violet LB saltはSigmaより購入した．Prostaglandin E₂（PGE₂）はCayman Chemical Company （Ann Arbour, MI），1α, 25-dihydroxyvitamin D3［1,25（OH）₂D₃］はBiomol Research Laboratories, Inc. （Plymous Meeting, PA），サケカルシトニン（sCT）はBachem（Torrance, CA），1型コラーゲンゲル（Cell matrix type 1-A）は新田ゼラチン（大阪），コラゲナーゼは和光純薬（大阪）より購入した．
新生児マウス頭蓋骨からの骨芽細胞の分離
　マウス骨芽細胞は既報^9-12)に基づき，１日齢ddyマウスの頭頂骨を採取，0.1％コラゲナーゼ及び0.2％ディスパーゼ（合同酒精，東京）処理し，得られた細胞（primary osteoblast: POB）を使用した．24穴プレート，10 cmディッシュにて10％FCSを含むα-MEMで37℃，5％CO₂存在下に培養した．実験には1-5継代の細胞を使用した．
Alkaline phosphatase （ALP）活性の測定
　24穴プレートにPOBを2.5×10⁴ cells/wellで播種し，D-グルコース（15－60 mM），L-グルコース（15－60 mM），マンニトール（15－60 mM），インスリン10^-7 M，TNFα （0.33－30 ng/ml）を添加してPOBにおけるALP活性の変化を確認した．ALP活性は培養液を除去した後，細胞をPBSで2度洗浄し超音波破砕し，Lowry法により測定した．またBio-Rad protein assay kit （Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）にて含有タンパク量を測定し単位蛋白量あたりの活性値として表示した．
RNAの抽出
　10 cmディッシュにPOBまたは骨髄細胞を5×10⁶ cell/dishで播種し，ほぼコンフルエントに達した後に各種因子（D-グルコース60 mM，L-グルコース60 mM，マンニトール60 mM，インスリン10^-7 M，TNFα 30 ng/ml）を添加した．0－48時間後，上清を除去しPBSで2回洗浄，既報¹³⁾のacid guanidinium-phenol-chloroform法にてtotal RNAを抽出した．
RT-PCRによるRNAの増幅
　上述の如く細胞より抽出したRNAを用いたcDNAへのreverse transcription （RT）は，1.0 μgのtotal RNAとともに2.5 μU/μlのreverse transcriptase，2.5 μMのrandom hexamer，1.0 mMのdNTP mixを42℃で1時間インキュベートして行った．本反応液の2 μlを用いて標的分子に特異的にデザインされたプライマーを用いてPCRを実施した．プライマーにはPOB上のreceptor activator of nuclear factor-κB （RANK） li- gandの発現をみるため sense 5'-CAGCACTCACTGCTTTTATAGAATCC-3'とanti-sense 5'-AGCTGAAGATAGTCTGTAGGTACGC-3'を，またosteoprotegerin （OPG）には sense 5'-ATGCAACACATGACAACGTG-3'とanti- sense 5'-GGAACCTCATGGTCTTCCTC-3'を用いた．破骨細胞前駆細胞に発現するRANKの発現の解析には sense 5'-AAGATGGTTCCAGAAGACGGT-3'と anti- sense 5'-CAGATAGTCAGTTCTGCTCGGA-3'を用い，コントロールとしてglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenage （GAPDH）の発現を評価するためsense 5'-CATGGAGAAGGCTGGGGCTC-3'，anti-sense 5'-AACGGATACATTGGGGGTAG-3'を用いた．RNAの増幅はPCR thermal cycler（宝酒造バイオ，東京）を使用した．PCRの条件はプレヒート94℃ 5分，変性94℃ 30秒，アニーリング55℃ 30秒，伸長68℃ 45秒としサイクル数は30回転を用いた．PCR産物は1.5％アガロースゲルにて電気泳動後エチヂウムブロマイド染色を施し，UV撮影にて記録した．画像解析システム（NIH image version 1.61）を用いてシグナル強度を評価し発現量を比較した．各プライマーはAmersham Pharmacia Biotech UK Ltd. （Buckinghamshire, UK）より購入した．
アポトーシスの検出
　チャンバースライド（Nunc, Napervill, IL）上にPOB（1×10⁴ cells/well）を播種した後，各種因子（D-グルコース60 mM，マンニトール60 mM，インスリン10^-7 M，TNFα 30 ng/ml）で刺激し0－48時間後bisbenzimide H 33342 fluorochrome, trihydrochloride （Calbiochem, La Jolla, CA）により核の蛍光染色を施し，形態学的変化を蛍光顕微鏡（Zeiss, Germany）下で観察した．また，POBと破骨細胞前駆細胞（5×10⁵ cells/dish）を10 cmディッシュに播種，コンフルエントに達する前にメディウムを0.1％BSA（ウシ血清アルブミン，和光純薬）を含有するα-MEMへ変更，各種因子を添加し24時間培養した．0.25％トリプシンに2％BSAを添加し接着細胞を上清中の浮遊細胞とともに回収した．PBSで洗浄後，アネキシンV-FITC溶液とヨウ化プロピジウム溶液（アネキシンV-フルオレセイン染色キット，和光純薬）を加え蛍光染色し，FACS Calibur （BECTON DICKINSON, San Jose, CA）にて蛍光強度を測定，Cell Quest（version 3.1）を用いて解析した．
成熟破骨細胞形成
　既報のごとく^9-11)，マウス破骨細胞は5週齢ddyマウスの長幹骨より採取した骨髄細胞（6×10⁵ cells/dish）とPOB（5×10⁵ cells/dish）を10％FCSを含むα-MEM，PGE² 10^-7 M，1,25（OH）₂D₃ 10^-8 Mを加え1型コラーゲンゲル上で7－8日間共存培養し作成した．光学顕微鏡において形成された多核巨細胞を確認し，1型コラーゲンゲルを0.2％コラゲナーゼで溶解，細胞を回収し実験に供した．
酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP）染色
　形成された多核巨細胞が破骨細胞であることを確認するため，既報の方法¹²⁾に準じてTRAP染色を行った．50 mM sodium acetate buffer，40 mM potassium sodium tartrate buffer （pH5.0），0.01％naphthol AS-MX phosphate，0.03 ％ fast red violet LB saltで細胞を20分間染色した．染色液除去後，蒸留水で洗浄し光学顕微鏡（Olympus CK40）下にTRAP陽性の多核細胞を観察した．
破骨細胞形成に及ぼす影響の検討
　24穴プレートに骨髄細胞（1.5×10⁵ cells/well）とPOB（2.5×10⁴ cells/well）を播種しD-グルコース（5.6－60mM），L-グルコース（30－60 mM），マンニトール（30－60 mM），インスリン（10^-7 M），TNFα（30 ng/ml）の存在下に7-8日間共存培養し，破骨細胞形成に対して各種因子が及ぼす影響を評価した．
破骨細胞による骨吸収能の評価
　骨吸収は既報^10-11)に従い，1型コラーゲンゲル上で作製した成熟破骨細胞を回収し，象牙切片（直径5 mm，厚さ～50 μm）上に播種し，2－3時間後D-グルコース（30－60 mM），マンニトール（30－60 mM），インスリン（10^-7 M），TNFα （0.33－30 ng/ml）を添加した．48時間培養後メディウムを除去しPBSにて洗浄，1.0 N NH₄OH存在下に超音波処理し表層の細胞を除去した後，マイヤーヘマトキシリン染色液（和光純薬）にて染色した．蒸留水にて洗浄後，顕微鏡下に骨吸収窩を観察した．象牙切片上に形成された骨吸収窩数および面積を画像解析システム（NIH image）を用いて計測した¹³⁾．
アクチンリング形成能の評価
　コラーゲンゲル上で作製した成熟破骨細胞を回収しチャンバースライド上に播種，D-グルコース60 mM，マンニトール60 mM，TNFα 30 ng/mlで刺激し6－24時間後10％中性緩衝ホルマリン溶液にて細胞を固定，PBSで洗浄後0.1％ Triton X-100 （Research Organics Inc., Cleveland, Ohio）にて処理した．ローダミンファロイジン染色液（Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon）を加え約10分染色しPBSにて洗浄，蛍光顕微鏡（Zeiss, Germany）にてアクチンリングを観察した．
統計学的処理
　測定結果は全てmean±standard deviationにより示し，統計学的処理は分散分析を実施した後にSheffeの検定を用いてp＜0.01を有意差ありと評価した．

　結　果

グルコース，インスリンおよびTNFα が骨芽細胞系細胞のALP活性に及ぼす影響の検討
　高グルコース環境は骨芽細胞系細胞を含めていくつかの細胞系で細胞内情報伝達を阻害する可能性が示されている¹⁴⁾．まず持続的高グルコース環境あるいは高インスリン環境が骨芽細胞ALP活性に及ぼす影響をPOBを用いて検討した．Fig. 1Aに示すように培養期間とALP活性を検討したところ，培養9－21日の間はALP活性がほぼ一定しておりこの期間での評価が適切と考えた．各種濃度のグルコース含有培養液およびインスリン環境で10日間培養しALP活性を評価したところ，Table. 1に示すように60 mMの高濃度グルコース環境や浸透圧コントロールのマンニトール処理は10日間の処理で大きな影響を与えなかった．またインスリン10^-7 Mによる処理もALP活性に影響を与えなかった．
　2型糖尿病でインスリン抵抗性に関与するとされるTNFα が，骨芽細胞のALP活性に与える影響を検討したところ，Fig. 1Bに示すように培養液中へのTNFα の添加は用量依存性にPOBのALP活性を低下させ，その効果は3.3 ng/ml以上より高濃度で有意（p＜0.01）であった．

Fig. 1. Time course and effects of TNFα on ALP activity in mouse POBs. (A) Time course of ALP activity in POBs. POBs were cultured for the times indicated and ALP activity in the cells was measured, as described in Materials and Methods. (B) Effects of TNFα on ALP activity in POBs. POBs were cultured for 5 days in α-MEM containing 10% FCS. The media were then replaced with fresh media containing various concentrations of TNFα and incubation contuinued for a further 5 days. ALP activity in the cells was measured as described in Materials and Methods. Each point represents the mean ± SD for six wells. *p＜0.01 vs control cells.

Table 1. Effects of D- or, L-glucose and mannitol on ALP activity in mouse primary osteoblasts

グルコース，インスリンおよびTNFα が骨芽細胞系細胞のアポトーシスに与える影響
　高グルコース環境はいくつかの細胞系でアポトーシスを促すことが報告されている．そこで我々は高グルコース環境，インスリン，TNFα がPOBのアポトーシスに及ぼす影響を検討した．POBをグルコース，インスリン10^-7 M，TNFα 30 ng/mlで刺激し24時間処理した後，アポトーシスを生じた細胞をHoechst 33342を用いた核の蛍光染色で評価した．グルコース60 mM，マンニトール60 mMによる処理はグルコース5.6 mM（コントロール）と差を認めなかったが，TNFα 処理群は著明な核の断片化を誘導した（Fig. 2B）．またアポトーシス細胞をアネキシンV，ヨウ化プロピジウムを用いた2重染色を行いフローサイトメトリーで1×10⁴個の細胞を測定したところ，Fig. 3に示すようにマンニトール60 mM（A），グルコース60 mM（B）でのPOBにおけるアポトーシス細胞は12％前後でコントロールと同等であったが，TNFα30 ng/ml 処理群では約24％まで増加した（C）．

Fig. 2. Effects of mannitol, glucose and TNFα on DNA fragmentation of mouse POBs. POBs were incubated with mannitol (60 mM), glucose (60 mM) and TNFα (30 ng/ml) for 24 h. Cells were stained by bisbenzimide H 33342 fluorochrome trihydrochloride and morphological changes of nuclei were observed as described in Materials and Methods. Representative nuclear patterns are shown.

Fig. 3. Effects of mannitol, glucose and TNFα on early apoptosis in mouse POBs. Subconfluent cells were treated with mannitol (60 mM), glucose (60 mM) and TNFα(30 ng/ml ) in α-MEM containing 0.1% BSA for 24 h. Adherent cells were collected after trypsinization and washed twice with PBS carefully. Cells were stained for Annexin V and with propidium iodide and the number of apoptotic POBs was studied by flow cytometric analysis as described in Materials and Methods. The proportion of apoptotic cells were 10.9% in control cells (0.1% BSA); 12.5% in cells treated with 60 mM mannitol (A); 12.6% in cells treated with 60 mM glucose (B); 23.7% in cells treated with 30 ng/ml TNFα(C); 37.3% in cells treated with UV light for 5min (D).

グルコース，インスリンおよびTNFα が破骨細胞形成に及ぼす影響の検討
　糖尿病における骨代謝異常に関して，骨吸収を営む破骨細胞の役割は充分に検討されていない．そこで我々はマウス破骨細胞形成系を用いてグルコースとインスリンの作用を検討した．一日齢のマウス頭蓋骨から得た骨芽細胞と5週齢の雄性マウスより得られた骨髄細胞をPGE₂ 10^-7 M，1,25（OH）₂D₃10^-8 Mの存在下に約7日間培養し成熟破骨細胞を誘導した．Table. 2に示すように，高濃度（60 mM）のD-グルコース，L-グルコース，マンニトールの存在下にも破骨細胞は形成され，それらの濃度の変化（5.6－60 mM）は破骨細胞形成に対し影響をもたらさなかった．
　共存培養系ではPGE₂が成熟破骨細胞の分化を導き，培養7日目に多核の破骨細胞数が最大となる．本実験系にTNFα 単独処理およびPGE₂との共存下における破骨細胞形成能の変化を調べた．TNFα 単独でも破骨細胞形成は認められたが，その効果はPGE₂と比べると弱く，PGE₂とTNFα による処理では7日目の多核破骨細胞数はPGE₂単独群に比し有意に少なかった．マウスTNFα は，TNF1型受容体（TNFR 1: p55）と2型受容体（TNFR 2: p75）の2つの受容体に作用し，多くの作用はTNFR 1を介する．TNFR 1からのシグナルはTRADD （TNFR associated death domain protein）とFADD （Fas-associated protein with a novel death domain）を介しカスパーゼを活性化しアポトーシスを誘導するシグナルと，TRAF 2を経てMAPキナーゼ経路を活性化することでIκBのリン酸化・分解を経てNF-κBを活性化し破骨細胞への分化を促す経路に分かれる．Fig. 4に示したPGE₂の破骨細胞形成を減弱するというTNFα の効果は，抗マウスTNFR 1抗体（Anti-TNFR p55, Genzyme, Cambridge, MA）の添加により改善した．この改善効果は，骨芽細胞でのアポトーシスシグナルを減弱したことが関与すると考えられた．

Fig. 4. Effects of TNFα and PGE₂ on mouse osteoclast formation. Mouse POBs prepared from newborn mouse calvaria and bone marrow cells were co-cultured in α-MEM containing 10% FCS with or without PGE₂ (10^-7 M) and TNFα(30 ng/ml) for 7 days. Anti-mouse p55 TNF receptor antibody (10 μg/ml) and control IgG (10 μg/ml) were added to culture media from day 0. The number of TRAP-positive multinuclear cells were counted and are shown as the mean ± SD for four wells. *p＜0.01.

Table 2. Effects of D- or, L-glucose and mannitol on multinuclear osteoclast formation

グルコース，インスリンおよびTNFα が破骨細胞分化誘導因子とその関連蛋白の発現に及ぼす影響の検討
　骨芽細胞は細胞膜上にreceptor activator for NF-κB ligand （RANKL）を発現し，破骨細胞前駆細胞のRANK（RANKL受容体）に作用し，多核化をもたらし成熟破骨細胞へと分化を導く．本実験で認められたTNFα での破骨細胞形成の抑制がRANKLあるいはRANKの発現の変化によるか否かを明らかにするため，POBにおけるRANKLと破骨細胞前駆細胞におけるRANK発現への影響を検討するとともに，RANKLのおとり受容体（decoy receptor）であるosteoprotegerin （OPG）の発現をRT-PCR法で検討した．Fig. 5に示すようにTNFα でPOBを処理してもRANKL，OPGのmRNA発現には大きな影響をもたらさなかった．また，破骨細胞前駆細胞をTNFα 処理してもRANKの発現レベルには影響を及ぼさなかった（Fig. 6）．
グルコース，インスリンおよびTNFα が骨吸収能に及ぼす影響の検討
　破骨細胞の骨吸収能に及ぼす持続的高グルコース環境あるいはインスリンの影響を象牙切片上の骨吸収面積およびアクチンリング形成で検討した．骨吸収能はマンニトール60 mMによる処理でも影響を受けず骨吸収窩を形成したが，高濃度（30－60 mM）のグルコース処理は濃度依存的に骨吸収能を抑制した（Fig. 7A）．またTNFα で処理した場合，0.33 ng/ml以上の濃度で有意な骨吸収能の低下をもたらした（Fig. 7B）．
成熟破骨細胞をチャンバースライド上に播種し各種因子で6－24時間刺激した後固定し，ロダミン・ファロイジンで染色し蛍光顕微鏡下でアクチンリングの形成状態を観察した．アクチンリングが完全に残存している破骨細胞（Fig. 8A）とアクチンリングが破綻している破骨細胞（Fig. 8B）数をそれぞれ計測し，アクチンリング形成率として評価した．マンニトール60 mMで24時間処理してもコントロールと同程度のアクチンリング形成率を認めた．TNFα30 ng/mlおよび高濃度グルコース（60 mM）ではそれぞれ有意にアクチンリング形成が阻害された（Fig. 8C）．グルコース，TNFα添加群とも高濃度であるほど全周性に形成されているアクチンリングの数は減少していた．

Fig. 5. Effects of mannitol, glucose, insulin, TNFα, and PGE₂ on RANKL and OPG mRNA expression in mouse POBs. POBs were treated with mannitol (60 mM), glucose (60 mM), insulin (10^-7M), TNFα (30 ng/ml) and PGE₂ (10^-7M) in α-MEM containing 10% FCS for 24 h. Total RNA was extracted from the cells. RNA was reverse transcribed and subjected to 30 cycles of PCR for RANKL and OPG mRNA amplification and 30 cycles for GAPDH mRNA amplification using specific primers, as described in Materials and Methods. Representative signals of PCR products are shown.

Fig. 6. Effects of mannitol, glucose, insulin and TNFα on RANK mRNA expression in M-CSF dependent osteoclast precursors. Mouse bone marrow cells were cultured in α-MEM containing 10% FCS and M-CSF (100 ng/ml). M-CSF dependent osteoclast precursors were subcultured and treated with mannitol (60 mM), glucose (60 mM), insulin (10^-7 M) and TNFα (30 ng/ml) in α-MEM containing 10% FCS for 24 h. Total RNA was extracted from the cells. RNA was reverse transcribed and subjected to 28 cycles of PCR for RANK mRNA amplification and 28 cycles for GAPDH mRNA amplification using specific primers, as described in Materials and Methods. Representative signals of PCR products were shown in this figure.

Fig. 7. Effects of mannitol, glucose (A) and TNFα (B) on pit formation. Mature mouse osteoclasts were prepared from co-cultures of newborn mouse calvaria and bone marrow cells. Cells were co-cultured on type I collagen gels in α-MEM containing 10% FCS in the presence of 1,25(OH)₂D₃(10^-8 M) and PGE₂ (10^-7 M) for 7 days. Cells were gently collected from the collagen-coated dishes after treatment with 0.2% collagenase for 10 min. Equal numbers of osteoclasts were settled onto dentine slices. The OCs were then treated with mannitol and glucose (A), and various concentrations of TNFα (B) for 48 h. The area of bone resorbed was quantitated, as described in Materials and Methods. Each point represents the mean ± SD for four dentine slices. P ＜0.01 vs. control cells.

Fig. 8. Effects of mannitol, glucose, salmon calcitonin (sCT) and TNFα on actin ring formation in osteoclasts. Mature mouse osteoclasts were prepared from co-cultures of newborn mouse calvaria and bone marrow cells. Cells were co-cultured on type I collagen gels in α-MEM containing 10% FCS in the presence of 1,25(OH)₂D₃(10^-8 M) and PGE₂ (10^-7 M) for 7 days. Cells on the collagen-coated dishes were treated with 0.2% collagenase for 10 min and gently collected. Mature osteoclasts were inoculated into chamber slides. Cells were treated with mannitol (60 mM), glucose (60 mM), sCT (10^-9 M) and TNFα (30 ng/ml) for 24h. Cells were stained by rhodamine-conjugated phalloidin for 15min at room temperature. Actin ring formation was analyzed by counting cells with complete (A) and incomplete (B) ring structures.

　考　察

　従来糖尿病あるいは糖代謝異常が骨代謝調節機構に様々な形で影響を及ぼすことがin vitroおよびin vivoで示されてきた．その結果，インスリン作用不足が骨芽細胞機能を低下させ，高グルコース環境の持続が細胞内代謝調節系に大きく影響する可能性などが提唱されてきた¹⁵⁾．しかしながら持続的高血糖がもたらされる2型糖尿病では，単に骨のミネラル量だけではない骨の質的変化も易骨折性に関与するのではないかと推測される．例えばKatayamaらはストレプトゾトシンで膵β細胞を破壊した1型の糖尿病モデルラットの骨中にadvanced glycation end productsが増加し骨芽細胞の機能が障害されることを明らかにし¹⁶⁾，また最近我々は2型糖尿病モデルラットであるGKラットで，高血糖の持続期間と骨強度の減少が有意に相関することを認めている⁵⁾．糖尿病は様々な要因が病態形成に寄与しているが，インスリン抵抗性が強く関与する2型糖尿病では脂肪細胞から分泌され局所で作用するTNFα が病態に影響をもたらす可能性も考えられている．特に骨においては加齢と共にその内部組織である骨髄の脂肪化が起こり，インスリン抵抗性の状態では骨髄脂肪細胞からのTNFα の産生が増大しやすく病態形成に寄与する可能性も推測される．
　Inabaらは骨芽細胞様細胞（MG-63）を高糖濃度下で培養すると1,25(OH)₂D₃，PTH，IGF-1に対する応答性の低下，オステオカルシンの産生減少を生じ，この反応の一部はアルドース還元酵素阻害剤の添加により回復したと報告している¹⁷⁾．しかし我々の検討では骨芽細胞を60 mMまでの高濃度グルコースに暴露しても骨芽細胞のALP活性，共存培養系での破骨細胞形成支持能には影響を及ぼさなかった．我々の結果は短期間の高血糖への暴露自体が骨芽細胞に対して細胞障害性をもたらすというよりは，糖尿病に伴う他の病態（インスリン作用不足，慢性の高血糖環境による組織のグリケーションなど）が糖尿病での骨脆弱性に関与する可能性を示している．
　Kitajimaらはhuman T cell leukemia virus type 1 （HTLV1）感染細胞（MT2）をマウス骨芽細胞系細胞（MC3T3E1）とともに培養すると，MC3T3E1細胞にアポトーシスが誘導されることを報告し，この効果がTNFα の中和抗体により抑制されること，またTNFα を投与するとMC3T3E1細胞にアポトーシスが誘導されることを示した¹⁸⁾．本研究でもPOBをTNFα で処理するとALP活性が抑制されると共に，骨芽細胞にアポトーシスが誘導されることが判明した．これらの結果はTNFα が骨芽細胞に対して作用し，骨形成を抑制する方向に作用する可能性を示す成績と思われる．
　骨芽細胞による破骨細胞形成支持はSudaらが提唱しているように¹⁹⁾，骨芽細胞表面に発現し破骨細胞前駆細胞に作用する分子が介在することが示された²⁰⁾．骨芽細胞系ストローマ細胞で見出された破骨細胞分化誘導因子は既報のRANKのリガンドとして作用することがわかり，またモノサイト・マクロファージ系細胞の破骨細胞前駆細胞には，RANKと呼ばれるTNF受容体ファミリーに属する膜結合受容体が発現していることが判明した．そして従来から骨吸収を促進することが知られていた活性型ビタミンD（1,25(OH)₂D₃），副甲状腺ホルモン（PTH），PGE₂などはいずれもこのRANKLの遺伝子発現を増大させる．一方，KobayashiらはTNFα が破骨細胞前駆細胞に直接作用して破骨細胞の形成を促進する新たな破骨細胞分化経路があることをRANKノックアウトマウスを用いて証明し，慢性関節リウマチなどの病的な関節破壊に本経路が関与する可能性を示した²¹⁾．しかしながら生体内での通常の骨代謝回転では，破骨細胞の分化はホルモンやサイトカインなどを介して骨芽細胞の支持能に応じて調整されている．骨芽細胞と破骨細胞前駆細胞がともに存在する共存培養系はin vivoでの状況をより総合的に評価できる系と思われる．TNFα によるTNFR 1からのシグナルはTRAF 2を経てその下流に存在するMAPキナーゼ経路^22-24)を活性化，IκBのリン酸化・分解を経てNF-κBを活性化し破骨細胞への分化を促す．このTNFα による破骨細胞形成にはTNFR 1とTNFR 2の両方からのシグナルが重要である²¹⁾．今回の我々の検討でもTNFα は破骨細胞前駆細胞に直接作用し破骨細胞形成を促すが（Fig. 5），骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系にTNFα を加えると，むしろPGE₂など骨芽細胞を介して破骨細胞形成に作用する効果を減弱させた．この作用はTNFR 1からTRADDとFADDを介したシグナルが，カスパーゼ8を活性化し骨芽細胞にアポトーシスを導いたと考えられた．破骨細胞前駆細胞にTNFα が作用し破骨細胞の形成や生存を促進するという報告がなされているが，我々の検討では骨芽細胞に対してもTNFα は作用し，破骨細胞の支持能を低下させるという結果を得た．しかしTNFα はRANKL，OPGの発現を変化させなかったことからRANK-RANKL系を介さない経路の関与や，マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）や接着因子など他の破骨細胞支持因子への関与も推測され，今後はシグナル伝達に関する解析を含めさらに検討する必要がある.

　破骨細胞による骨吸収は，1．破骨細胞が発現する骨基質蛋白のオステオポンチンが骨表面に強固に接着し辺縁にアクチンリングによる明帯を構築し吸収窩を形成し，2．骨吸収面に形成される波状縁の細胞膜に存在するH⁺ポンプ（H⁺/K⁺-ATPase）よりH⁺が分泌されミネラルの溶解がもたらされ，3．蛋白水解酵素（リソソーム酵素，カテプシンK）の活性化が起こり，有機基質の分解を促進することで生じる¹⁹⁾．生体内の細胞の中で骨吸収を営むことができるのは破骨細胞のみであり，高度に統合された機能のどの段階が破綻しても骨吸収能の低下として観察される．今回，成熟破骨細胞を用いて骨吸収能に及ぼす高濃度グルコースとTNFα の影響を見たところ，高濃度グルコース環境への暴露とTNFα による刺激は，骨吸収を抑制した．破骨細胞のアクチンリング形成が影響を受けるか否かを検討したところ，Fig. 8Cに示すようにTNFα による刺激や高濃度グルコース処理において，全周性のアクチンリングを形成した細胞は減少していた．高濃度グルコースによりもたらされた骨吸収能抑制は，少なくとも一部は破骨細胞の機能が直接障害されアクチンリングの破綻が関与したと考えられ，またTNFα の効果は骨芽細胞の支持能の変化が関与していると想定されるが，今後はその機構のさらなる解析が必要と考えられる．また今後，グルコースとTNFα の相互作用に関する検討を進めることが必要と判断される．

　結　論

　今回のin vitroでの研究結果は，インスリン抵抗性の病態で存在する高濃度グルコースやTNFα が骨芽細胞と破骨細胞の機能を様々に修飾し，骨形成と骨吸収を抑制する可能性を示している．in vivoでの2型糖尿病モデルラットを用いた研究では，糖尿病において低代謝回転の骨代謝を導く可能性が示されており，今回のin vitroでの成績はそれらの研究結果を細胞レベルで支持する成績と考えられた．

　謝　辞

　本研究を遂行するに当たり，ご指導およびご鞭撻を賜りました埼玉医科大学第4内科学教室片山茂裕教授，飯高誠助教授，和田誠基講師，北濱眞司講師，長谷啓子実験助手，並びに教室員各位に深謝いたします．

　文　献

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