埼玉医科大学雑誌

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原　著

HeLa細胞におけるオレイン酸によるアポトーシスの機構：
IκBβ の誘導によるcaspase非依存性経路の関与

溝谷　香壽美，井上　郁夫

埼玉医科大学第４内科学教室
〔平成13年11月5日受付〕

The Mechanism of Apoptosis by the Oleic Acid in HeLa Cells : Caspase-independent Pathway by Induction of IκBβ
Kasumi Mizotani, Ikuo Inoue (Fourth Department of Internal Medicine, Saitama Medical School, Moroyama, Iruma-gun, Saitama 350-0495, Japan)

　Epidemiological studies of breast and pancreatic cancer in several Mediterranean countries, including Southern Europe, North Africa, and the Middle East have demonstrated that increased dietary intake of oleic acid may reduce a risk of cancer onset. It is well-known that eicosapentaenoic acid (EPA), which is one of the PUFAs, was demonstrated to inhibit proliferation of human leukemic HL-60 cells in vitro. We studied the mechanism of apoptosis in HeLa cells by oleic acids as compared with those by EPA, which was previously reported to induces apoptosis. In this study, we found that the fragmentation of DNA was detected in agarose electrophoresis and apoptotic features, such as cell shrinkage, concentration, and fragmentation of nucleus after addition by 100μM of oleic acids and EPA. After 24 hours of medication by EPA and oleic acid, the apoptosis-related proteins (Bax, Bcl-2, Fas, cytochrome C, Apaf-1, caspase 3) were analyzed by the Western blot analysis. The Bcl-2 expression was inhibited and the ratio of Bax/Bcl-2 expression increased at 50μM and 100μM oleic acid. The apoptosis-related proteins (Fas, cytochrome C, Apaf-1, caspase 3) were increased by 50μM and 100μM EPA. In contrast, there was not the significant change in expression of apoptosis-related proteins (Fas, cytochrome C, Apaf-1, caspase 3) at 50μM and 100μM oleic acid. Moreover, EPA significantly increased the activity of caspase 3, while oleic acid did not affect the caspase 3 activity. Our results indicate that the apoptosis of HeLa cells by oleic acids might be through caspase-independent mechanism. We also analyzed the change of NF-κB , IκBα and IκBβ, to which have been, recently, paid much attention with relation to apoptosis. We found that NF-κB was dose-dependently inhibited by oleic acid and IκBβ was dose-dependently increased, although there was no change in IκBα. Our results suggest that the apoptosis by oleic acids might be associated with IκBβ, indicating that the mechanism of apoptosis by oleic acid might be different from those by EPA.
Keywords: oleic acids, apoptosis, HeLa cells, NF-kB, IκBα, IκBβ
J Saitama Med School 2002;29:117-123
(Received November 5, 2001)

　緒　言

　アポトーシス¹⁾は1972年，Kerr，WyllieおよびCurrieらによって，ネクローシスと形態学的に異なる細胞死として発見され，定義された細胞死であり，遺伝子レベルで制御された細胞死の一型であると言われている．また，アポトーシスは個体発生における組織，臓器の形成に重要な働きをしているだけではなく，癌の発生とも深い関係を持つといわれている．本来個々の細胞には外界からの刺激に対して細胞内の環境を一定に保ち，細胞間の相互作用を正常に保とうとする能力があると言われている．しかし，DNA損傷，癌遺伝子異常発現により，細胞の持つ恒常性に異常が生じ，独自に不必要な分裂・増殖を行う細胞が出現する．これが癌化の初期である．しかしながら，細胞にはもともと生体防御機構が備わっており，遺伝子が障害された場合に，それを回復できる能力がある．さらに，その障害が多岐にわたる場合や，回復が容易でない場合，あるいは遺伝子の変異や増幅がもとで，その発現が異常亢進した場合などでは，その細胞を死滅させ，排除する能力をも備えている．これがアポトーシス誘導能である．
　以前よりω- 3系の多価不飽和であるエイコサペンタエン酸は癌細胞のアポトーシス誘導能を有し，癌細胞の増殖を抑制する事が知られている^2-4)．また，一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸を多量摂取している南ヨーロッパ，北アフリカ，中東などの地中海沿岸の国々では癌の死亡率が低いといわれている⁵⁾．さらに，ギリシャでは脂肪の40％がオリーブオイルから摂取されているといわれているが，ギリシャの女性の乳癌の発生率は，アメリカの女性のそれと比較すると，半分以下と著しく低いと報告されている^5-8)．さらに，スペインでのケースコントロールスタディでは，オリーブオイルを最も多く摂取していた女性では乳癌のリスクが減少していることも報告されている^5,9)．また，ギリシャの大規模なケースコントロールスタディおよびスペインでの小規模のケースコントロールスタディでも，乳癌のリスクがオリーブオイルの摂取量に反比例するとの報告もなされている^5,10,11)．また，イタリアで行われた最近のケースコントロールスタディの報告によれば，乳癌以外にもオリーブ油の摂取量が膵臓癌のリスクを著しく低下させるとの報告もある^5,12)．
　オリーブオイルの約70 %がオレイン酸であるため，これらオリーブオイルの作用はオレイン酸による作用と考えられ，オレイン酸の意義が，最近非常に注目されてきている⁵⁾．しかしながら，オレイン酸が濃度依存性に癌の発生を抑制するという仮説の証明は，現在のところまだ報告はなく，オレイン酸による癌細胞のアポトーシスの報告もまだなされていない．
　そこで今回我々は，ヒト子宮頸部癌細胞であるHeLa細胞のアポトーシス伝達機構を，癌細胞のアポトーシスを誘導する事が証明されているエイコサペンタエン酸のアポトーシス伝達機構と比較をし，最近アポトーシスとの関連で注目されているNF-κB，IκB α ，IκB β のオレイン酸による変化をウェスタンブロット法にて解析した．

　方　法

1　細胞株と細胞培養
　ヒト子宮頸部癌細胞であるHeLa 229細胞（大日本製薬，大阪，日本）を用いた．HeLa 229細胞は37℃，5％CO₂条件下で培養シャーレにFetal Bovine Serum（Invitrogen Corp, Carlsbad, USA）を10 %，ペニシリンストレプトマイシン（Invitrogen Corp, Carlsbad, USA）1 %を添加したD-MEM （High Glucose） with D-Glucose 4500 mg/dl L-Glu・NaHCO3（日研生物医学研究所，京都，日本）を用いて，初期濃度1×10⁴ 細胞/cm² で10日間静置培養した．培養したHeLa細胞に，エイコサペンタエン酸，オレイン酸を各々50μM，100μM 添加し，24時間後semi-confluent の状態で回収した．
2　アポトーシスの検出
　アポトーシスは，以前我々が実施した方法¹³⁾にしたがって，DNA ladderおよびHoechst 33258によるHeLa 229細胞の核の凝縮，濃染にて評価した．
　DNA ladderは，Apoptosis Ladder Detection Kit（Wako, Osaka, Japan）を用いて行った．Hoechst 33258によるアポトーシス細胞の検出及び細胞数の算出には，蛍光顕微鏡下（×400）で一視野当たり少なくとも500個の細胞からアポトーシス細胞計測を10回行い，百分率として算出した．
3　ウェスタンブロット
　HeLa 229細胞は10％SDS，PBSを用いて溶解し，ソニケーションを行った後14,000 g，4℃で10分間遠心分離し上清を抽出し蛋白測定を行った．培養したHela細胞の24時間後のアポト－シス関連蛋白の発現（Bax，Bcl-2，Fas，チトクロームC，Apaf-1，カスパーゼ 3）をウェスタンブロット法にて解析した．Hela細胞より調整した蛋白を各サンプル20μg /20μl になるようにPBSで調整し，2-メルカプトエタノール存在下で95℃，5分間熱処理した．泳動，転写後，5％スキムミルクを含む0.05 % Tween 20/PBSにより非特異的反応をブロックした後，一次抗体としてBcl-2 （mouse monoclonal antibody: BD Biosciences PharMingen, SanDiego, USA），Bax （rabbit polyclonal antibody: Santa Cruz, California, USA），チトクロームC （mouse monoclonal antibody: R&B System Inc, Minneapolis, USA），Apaf-1（goat polyclonal antibody: Santa Cruz, California, USA），カスパーゼ 3（rabbit polyclonal antibody: BD Biosciences PharMingen, SanDiego, USA），Fas （mouse monoclonal antibody: BD Biosciences PharMingen, SanDiego, USA），NFκ-B （rabbit polyclonal antibody: Santa Cruz, California, USA），IκBα（rabbit polyclonal antibody: Santa Cruz, California, USA），IκBβ（rabbit polyclonal antibody: Oncogene Research Products, Boston,USA）を，2次抗体にはHRP標識抗マウスIgヤギポリクロナール抗体，抗ウサギIgヤギポリクロナール抗体（ The Binding Site, Birmingham, UK），抗ヤギIgG （H＋L）（ICN Pharmaceuticals Inc, Cosla Mesa, USA）を，それぞれ反応させた．なおチトクロームCのミトコンドリアから流出した量を評価するため，160,000 g，20分間超遠心分離後の上清を使用した．以上，これらの検出には，ペルオキシターゼにより触媒されるルミノール系の化学発光ECL^TM（Amersham Pharmacia, Little Chalfont Buckinghamshire, England）を利用した．感光用フィルムとしては，ECL系の発光波長に一致した特性をもつHyperfilm ECL（Amersham Pharmacia, Little Chalfont Buckinghamshire, England）を用いた．フィルム上で検出したバンドをGAPDH （Biogenesis Ltd, Poole, England）で補正し，Macintosh，NIH imageを用いて定量，解析を行った．
4　カスパーゼ3活性測定
　カスパーゼ3活性は，以前我々が実施した方法¹³⁾およびコマーシャルキット（Promega Corporation, Madison, USA）にしたがって，異なった方法にて，確認した．我々が実施した方法を簡単に記す．細胞を回収後 400 g，5分間遠心分離し，1 mM EDTA，5 mM MgCl₂，1 mM EGTA，5 mMジチオスレイトール，1 mM phenyl methionyl sulfonyl fluorideを含む25 mM Heps-NaOH （pH 7.5）を用いて2回洗浄した．2分間ソニケーションを行った後，サンプルを4℃，160,000 gで20分間超遠心分離し，上清の蛋白濃度をBradford法で測定した．50μg 蛋白を50μM N-acetyl Asp-Glu-Val-Asp-a-4-methyl-coumaryl-7-amide （ac-DEVD-MCA）を用いて25 mM Heps-NaOH（pH7.5），10 % sucrose, 5 mM MgCl₂，10 mM dithiothreitolから成るprotease assay buffer 中に37℃，30分間インキュベートした．1 M酢酸を添加して酵素反応させた後，遊離したMCAsを励起波長 460 nmと蛍光波長 380 nmをスペクトロフルオロメーターで測定した．
5　統計
　全ての結果は独立した5 回の実験の平均値±標準偏差として表し，ノンパラメトリック検定のMann-WhitneyのU検定で行い，有意差はp＜0.05とした．

　結　果

1　DNA電気泳動による断片化DNAの検出
　アガロース電気泳動にて，100μM エイコサペンタエン酸あるいは100μM オレイン酸の添加24時間後に断片化DNAが検出された．またpositive control としてPMAを呈示した（Fig. 1）．
2　Hoechst 33258 染色によるアポトーシス細胞の検出
　蛍光顕微鏡下（×400）において，100μM エイコサペンタエン酸あるいは100μM オレイン酸の添加24時間後に，核の凝縮，濃染した典型的なアポトーシス細胞が検出され（Fig. 2-A），アポトーシス細胞の数が，エイコサペンタエン酸あるいはオレイン酸の添加量に依存して，有意に増加した（Fig. 2-B）．
3　ウェスタンブロット解析
　ウェスタンブロット法で，エイコサペンタエン酸あるいはオレイン酸投与後24時間のアポトーシス関連蛋白の発現を解析したところ，エイコサペンタエン酸で，Bax/BcL-2の比率はコントールと比較して差は認められなかったが（Fig. 3），Fas （CD95），チトクロームC，Apaf-1，カスパーゼ3の発現が50μM ，100μM で有意に上昇した（Fig. 4）．一方，オレイン酸においてBcl-2の発現が抑制され，Bax/Bcl-2の比率が50μM ，100μM において有意に上昇した（Fig. 3）．しかしながら，結果には示さないが，オレイン酸によってFas （CD95），チトクロームC，Apaf-1，カスパーゼ3はコントロールと比較して変化を認めなかった．
4　カスパーゼ3活性測定
　エイコサペンタエン酸において，カスパーゼ3活性は濃度依存性に有意に上昇し，またcaspase inhibitorによりカスパーゼ3活性が低下した（Fig. 5-A,B）．一方，オレイン酸においては，コントロールと比較して変化を認めなかった．これにより，エイコサペンタエン酸によりカスパーゼ3が活性化することが示された．
5　オレイン酸のNF-κB ，IκBα，IκBβ への作用
　オレイン酸ではNF-κB は濃度依存性に低下し，IκBβ は濃度依存性に上昇したが，IκB α には変化は認められなかった（Fig. 6）．

　考　察

　癌予防および治療としての食事療法は，容易で低コストで，体内の新陳代謝を促し，正常細胞に害を及ぼさないという理由で薬物療法に比較し重要である^2,14,15)．その中でも，植物および動物性油から主に構成される多価不飽和脂肪酸（PUFAs）は，癌細胞の増殖を調節しているといわれている^2,16-18)．PUFAsの中でも，特に魚油は，in vitroではあるが，白血病細胞の増殖を抑制する事が明らかとなっている^2,4,19,20)．加えて，魚油は，正常細胞や全ての動物において，全く副作用が認められないと報告されている ^2,21-23)．PUFAsの抗癌作用機序の仮説としては，細胞膜の組成を変化させたり，eicosanoid を形成したり，フリーラジカル産生抑制・消去作用など，幾つか報告されている ^2,24-26)．
　今回の我々の成績では，単価不飽和脂肪酸であるオレイン酸もPUFAsの中の魚油の主要な脂肪酸であるエイコサペンタエン酸と同様にアポトーシスを誘導し，癌予防および治療として応用できる可能性が示唆された．
　そこで，我々はエイコサペンタエン酸およびオレイン酸によるアポトーシス誘導能を比較検討した．エイコサペンタエン酸およびオレイン酸により，DNAの断片化および典型的なアポトーシス細胞の増加を認め，エイコサペンタエン酸およびオレイン酸により，明らかにHeLa細胞はアポトーシスをもたらした．
　次に，エイコサペンタエン酸およびオレイン酸による，アポトーシスに関連した調節遺伝子の蛋白発現の変化を比較検討した．オレイン酸によりBcl-2の発現が抑制され，Bax/Bcl-2の比率が上昇した（Fig. 2）．しかしながら，Fas （CD95），チトクロームC，Apaf-1，カスパーゼ3には，オレイン酸により変化を認めず，カスパーゼ3活性にも変化は認められなかった．一方，エイコサペンタエン酸はFas （CD95），チトクロームC，Apaf-1，カスパーゼ3の発現を上昇させ（Fig. 3），カスパーゼ3活性も有意に上昇した．以上の結果は，オレイン酸によるアポトーシスの機序が，エイコサペンタエン酸によるアポトーシスの機序と異なり，カスパーゼ非依存的な別の細胞死のプログラムを活性化する可能性を示唆している．
　次に我々は最近アポトーシスとの関連が注目されていて，炎症過程に関連する転写因子であるNF-κB が，どのように，オレイン酸により変動するかを検討した．Fig. 4で示しているように，オレイン酸ではNF-κB が濃度依存性に低下し，IκB β が濃度依存性に増加した．しかしながら，エイコサペンタエン酸ではNF-κB，IκB α，IκB β の変化を認めなかった．
　近年，正常細胞および癌細胞のアポトーシス調節におけるNF-κB の役割が広く研究されている²⁷⁾．ホジキン病はもちろん乳癌細胞のBリンパ球におけるNF-κB の活性化は，これらの細胞に対してアポトーシスを抑制するとの報告がある^27-30)．TNFαなどによるNF-κB の活性化は癌細胞に対してアポトーシスを抑制し，NF-κB が癌治療に対する抵抗性と関係しているとも報告されている^27,31-37)．これらの結果から，アポトーシスに関連する遺伝子の発現はNF-κB によって調節されている可能性があり，癌の治療として，NF-κB の活性化を抑制する治療が考えられる．さらに，NF-κB はアポトーシスのみならず，細胞増殖・分化を調節したり，免疫反応や炎症をも調節している^27,38-41)．種々の刺激に対して，NF-κB は核に移行し，多くの標的遺伝子の発現を誘導する．NF-κBの活性化は，NF-κB の核への移行による．そしてそれはIκB により調節を受けている^38,42)が， IκB にはIκBα，IκBβ，IκBγ，IκBε，Bcl-3の存在が報告されており³⁸⁾，いずれのIκB も，NF-κB の領域部位をマスクし，DNAとの結合活性を抑制し，NF-κB の核内への流入を抑制する作用を有する⁴³⁾．さらに，様々な刺激に際して，IκB kinaseによりIκB は速やかにリン酸化され，ユビキチンが負荷され，IκB がデグラデーションをうける^27）．オレイン酸により，IκBβ のユビキチン化が抑制されていることも考えられる．また，最近では，ミトコンドリア膜間隙にIκB α およびNF-κB 複合体が貯留することで，アポトーシスを調節しているとの報告があり^44,45)，ミトコンドリアの膜に存在するBaxおよびBcl-2が，ミトコンドリアに貯留したIκBα およびNF-κB 複合体によりどのように調節を受けているかは，興味あるところである．また，NF-κB 活性化はBcl-2の発現に影響しているという報告はあるが ^46,47），直接Bcl-2遺伝子を調節しているという報告は現在のところ認められていない．また様々な細胞において，NF-κB 抑制はBaxの発現を増加させ，Bcl-2の発現を減少させるとの報告もあり²⁷⁾，今後，オレイン酸により変動するBax，Bcl-2，NF-κB ，IκBβ がどのように相互作用しているのか，またオレイン酸がどのような機序でI κBβを誘導するのか，さらに，どのような機序でIκB 蛋白ファミリーの誘導の違いが生じるのかを検討する必要がある．加えて，オレイン酸の抗癌作用の機序として，PUFAs同様，オレイン酸による細胞膜の組成変化，eicosanoidの形成，フリーラジカル産生・消去作用なども検討する必要があると考える．

　結　論

　オレイン酸によるHeLa細胞のアポトーシスは，エイコサペンタエン酸による機序とは異なり，カスパーゼ非依存性経路によりIκBβ が関わるアポト－シス伝達機構の存在が示唆された．

　謝　辞

　稿を終えるにあたり，ご指導御校閲賜りました埼玉医科大学第四内科学教室，片山茂裕教授に深謝いたします．また，本研究に協力頂きました佐藤さわ子実験助手に感謝いたします．

　文　献

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