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原　著

エストロゲンはアンジオテンシン変換酵素の発現を制御する

山内　康弘

埼玉医科大学腎臓内科学教室
〔平成13年12月21日受付〕

　エストロゲンはレニンーアンジオテシン系の各要素の発現に関与するといわれている．レニンーアンジオテンシン系の基質であるアンジオテンシノーゲンは，主に肝臓で産生される^1,2）．肝にはエストロゲンレセプターが存在しており^3-5），またアンジオテンシノーゲン遺伝子上流には，エストロゲンレセプター結合部位が確認されている^6）．ピル服用時のように経口的にエストロゲンを投与すると，腸で吸収されたエストロゲンは門脈を経て直接肝臓へ流入し，アンジオテンシノーゲンの産生を増加させる^7）．
　基質の変換酵素であるレニンは，腎臓の傍糸球体装置で産生される．その遺伝子上流にエストロゲンレセプター結合部位の存在が報告されており^8），エストロゲンの関与が示唆されるが，エストロゲンの作用によるその活性は増加^9,10），減少^11）または変化しない^12）との報告があり一致した見解は得られていない．
　もう一つの重要な調節因子であるアンジオテンシン変換酵素は，主に血管内皮細胞で産生される．これまでのところ，アンジオテンシン変換酵素の遺伝子上流にはエストロゲンレセプター結合部位は認められておらず^13-15），その遺伝子発現への直接的な作用についても明らかでない．エストロゲンによるその発現の変化に関しての報告は少なく^16），またエストロゲンによるその生理活性の変化に関しても減少^9,10）または変化を認めない^11）などの報告があり，エストロゲンがアンジオテンシン変換酵素の発現に関与しているかは依然不明のままである．
　またアンジオテンシンII受容体に対してもエストロゲンはその発現を抑制して血管の収縮や平滑筋細胞の増殖を抑制することが報告されている^17,18）．
　このようにエストロゲンはアンジオテンシノーゲンの産生を増加させ，アンジオテンシンII受容体の発現を抑制するとの見解は得られてきているが，レニンおよびアンジオテンシン変換酵素の産生に関しては見解が一定でなく，特にアンジオテンシン変換酵素に関しては，エストロゲンがその発現に関与しているかは未だ明らかとなっていない．
　今回我々は，エストロゲンがアンジオテンシン変換酵素の発現を制御するかを自然発症高血圧ラットとヒト臍帯静脈内皮細胞を用い検討した．

実験　1.　卵巣摘出した自然発症高血圧ラット（spontaneously hypertensive rat：SHR）におけるエストロゲン（17beta-estradiol：E₂）補充療法

対　象
　14週齢のSHR（SHR等疾患モデル共同研究会，千葉県船橋市）の雌（30匹）を対象とした．

方　法
　14週齢のSHR雌（30匹）をC群：対照群（n＝10），OVX群：卵巣摘出群（n＝10）およびOVE群：卵巣摘出後E₂補充群（n＝10）の3群に分けた．各操作は，pentobarbital sodium（大日本製薬（株），大阪）を腹腔内に50 mg/kg投与し麻酔下で行った．C群は，腰背部および頚背部を切開後，縫合した．OVX群は，左右の腰背部より開腹し左右の卵巣を摘出，さらに頚背部を切開し皮下に1.5 mg/pellet/90 daysのplacebo pellet（Innovative Research of America, FL, USA）を移植した．OVE群は，左右の腰背部より開腹し左右の卵巣を摘出，さらに頚背部を切開し皮下に1.5 mg/pellet/90 daysのE₂を含有するpellet（E₂-pellet, Innovative Research of America, FL, USA）を移植^19-21）した．E₂の投与量はBrosnihanらの方法を参考^19,21）に決定した．その後8週間にわたって経過観察し，2週間毎に血圧測定を行った．実験終了時（22週齢時）に断頭採血し，Angiotensin I（AngI），Angiotensin II（AngII），plasma renin activity（PRA），Angiotensin converting enzyme（ACE）およびE₂の濃度を測定した．その後，腎臓を摘出し液体窒素を用いて急速凍結し，−80℃で保存後RNAを抽出しACEのmessenger RNA（mRNA）をRNase protection assay（RPA）を用いて定量した．
SHRの血圧測定方法
　血圧を2週毎に測定した．収縮期血圧はtail cuff法（ソフトロン非観血式自動血圧測定装置，BP-98A 株式会社ソフトロン，東京）を用いて5回連続して測定し，その最高ならびに最低血圧を除いた3回の平均血圧を用いた．
血液生化学的検討
　血漿AngI，AngII，PRA，ACEおよびE2を測定した．採血した血液は，氷冷したEDTA・2Na入り採血管に注入し，それぞれの検体は直ちに遠心分離し上清を採取し，測定するまで−20℃で凍結保存した．
　AngI および AngII の測定は，RIA2 抗体法（トレーサー溶液：¹²⁵ I- Angiotensin Iおよび¹²⁵ I - Angiotensin II試薬，第1抗体液：抗AngIおよび抗AngII抗体ウサギ血清，第2抗体液：抗ウサギ抗体ヤギ血清）により測定した^22,23）．PRAはガンマー・コートTMレニンキット（デイドベーリング株式会社，東京）を用いて，RIA2抗体法により測定した．ACEはP-ヒドロキシベンゾイルーグリシルーL-ヒスチジルーL-ロイシンを基質とするACEカラーキット（富士レビオ（株），東京）を用いて，505 nmで比色定量した．E₂はDPC・エストラジオール二抗体キット（Diagnostic Products Corporation, LA, USA）を用いて，RIA2抗体法により測定した．なおACE活性の測定限界値は1.0 IU/L/ 37℃であり，それ以下となったものは統計処理上0として処理をした．（intra-assay：9.6 %， inter-assay variation：10.8 ％）
実験　2．ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell：HUVEC）でのACE発現に関する実験

対　象
　E₂の作用を確認するためにHUVEC（Clonetics, MD, USA）を用いACE mRNAの発現を検討した．

方　法
　5回目の継代の時にphenol-red freeのendothelial cell basal medium（EBM）（Clonetics, MD, USA）を用い細胞培養を行った．その後18時間後（70〜80％コンフルエント）にE₂（10^-9，10^-8，10^-7M）を添加し培養細胞を0，6，12および24時間後に採取，またAngII（10^-8，10^-7，10^-6M）添加後，0，1，2，3および4時間後に採取した．またE₂（10^-7M）とtamoxifen（10^-6M）添加12時間後に培養細胞を採取した．培養細胞の採取は，dish内の液体培地を吸引除去しPBSで洗浄後，TRISOL（Gibco BRL, MD, USA）を加えて撹拌した後チューブに回収し，mRNAを抽出するときまで−80℃で保存した．
HUVECの培養条件
　HUVECの培養には，添加因子セットEGM2（Clonetics, MD, USA）と 60℃，30分で非動化したCharcoal/Dextran treated FBS（Hyclone, UT, USA）（最終濃度：0.2 %）を添加したEBM2液体培地（Clonetics, MD, USA）を用いてHUVECの培養をおこなった．培養は付属のプロトコールに準じて行った．5回目の継代の時にphenol-red freeのEBM（Clonetics，MD，USA）を用い同様に細胞培養を行い実験に用いた．
RNAの抽出
　SHRの腎臓およびHUVECの培養細胞にTRISOLを加え，ホモジナイザーおよびテフロンコッターを用いて均質化した後，TRISOLのプロトコールに準じてtotal RNAの抽出を行い実験に用いるまで−20℃で保存した．
Probeの作成
　ヒトおよびラットのACE cDNAのシークエンス^24,25）からprimerを設計した．
ヒト：5’primer-CTGCTGCTCTTCCTGGGCATCGC
3’primer-ACCAGTGTTCCCATCGCAGTCTCTGG
ラット：5’primer-TCGCGTCAACTTCCTGGGTATGTACC
3’primer-AGGGTCACCTCAGGAGTGTCTGAGC
またinternal controlとして，Gallagherらの報告^16）を参考に，Elongation factor 1 alpha（EF1α）を用いた．
ヒト：5’primer-GTTGATATGGTTCCTGGCAAGCC
3’primer-AGACTTGGTGACCTTGCCAGCTCC
ラット：5’primer-ACAAGAAGGCTGCAGGAGCTGGC
3’primer-TTCTTCCACCACTGATTAAGAGTG
各primer setを用いて，HUVECおよびSHRの腎のtotal RNA（0.5μg ）をtemplateとし，high fidelity RNA PCR kit（takara， 東京）を用い，Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction（以下RT-PCRと略す）を行った．RT-PCRは，high fidelity RNA PCR kitのプロトコールに準じて行った．なお，PCRの条件は94℃ 30秒，62℃ 30秒，72℃ 1分を30 cycleとした．このPCR反応液を1.5％アガロースゲルを用い110 V 60分間泳動し，その後エチジウムブロマイドで染色した．染色したアガロースゲルを長波長のUVランプ（BLAK-RAY LAMP （LONGWAVE UV-365NM） ：ULTRAVIOLET，UVL-21，CA, USA）下で，目的のサイズのバンドを切り出し，チューブ（Non-Sterile ULTRAFREE-MC：0.22μm filter unit， MILLIPORE， MA， USA）に回収した．このチューブを用いゲルからDNAを抽出し，フェノール/クロロフォルム処理およびエタノール沈殿を行い精製した．DEP処理水を加え溶解しTAクローニングに使用するまで4℃で保存した．
　TAクローニングは，TOPO TA cloning kit（ invitrogen, CA, USA ）を用い，kitのプロトコールに準じて行った．その後，この反応液をcompetent cell（dH5α）（invitrogen, CA, USA）に加え，氷中に2分，37℃で3分，氷中に5分でトランスフォーメーションさせた．このトランスフォーメーションさせたcompetent cell（dH5α）をampicillin（ABPC，和光，東京）を含む10 cm dishのLA培地（Tryptone peptone（BECTON DICKINSON, MD, USA）， Dried Yeast Extract-S（日本製薬（株），東京），NaCl（和光，東京），BACTO-AGAR（精末寒天，松栄寒天（有），東京））に移し，IS42 incubator（IS42, Yamato，東京）で37℃ 15時間培養した．培地上に形成されたコロニーからのダイレクト PCR法によりligation checkを行った．なおPCRの条件は94℃ 20秒，62℃ 20秒，72℃ 1分を30 cycleで行った．またプラスミドの調整は，アルカリ−SDS法および塩化セシウム平衡密度勾配遠心法に準じて行った．この精製したプラスミドを制限酵素のPvuII（40 units/μl，和光，東京）を用い切断し，probeのlinearized templateとして用いた．インサートの配列と方向は，CEQ2000 sequencer（BECHMAN COULTER, CA, USA）を用いて確認した．
RNase protection assay（RPA）
　Riboprobeは，SP 6 polymerase（Roche, IN, USA）および [α-32P]UTP（400 Ci/mmol，室町化学，東京）を用い，SP 6 polymeraseに付属のプロトコールに準じてラベルした．ラットおよびヒトのriboprobeは，ACE cDNA 断片を含む pCRIITOPO プラスミド（pCRIITOPO, invitrogen, CA, USA）をPvuII（TAKARA，東京）によって切断して，ラットの直鎖ACE riboprobeは447塩基で，予想されるprotect bandは210 bp（3764−3973塩基），またヒトの直鎖ACE riboprobeは503塩基で，予想されるprotect bandは268 bp（3740−4008塩基）とした．今回，internal controlとしてEF1αの断片を用いた．同様にEF1α cDNA断片を含むpCRIITOPOプラスミドをPvuIIによって切断した．予想されるラットのprotect bandは125 bp（1373−1499塩基）で，また予想されるヒトのprotect bandは135bp（1235−1400塩基）とした．またリボプローブの活性は，液体シンチレーション（LSC-3500， アロカ（株），東京）を用いて測定した．サンプルのtotal RNA：10μg と，ACE：5×10⁵ cpmおよびEF1α：5×10⁵ cpmのriboprobeをハイブリバッファー（40 mM PIPES（pH6.4）（和光，東京），4 mM NaCl，1 mM EDTA （pH8.0）， 80% formamide（和光，東京））に加え45℃，15時間ハイブリダイゼーションを行った．ハイブリダイゼーションしなかった一本鎖のRNA処理に，RNase A （Roche，IN，USA）とRNase T1（Roche，IN，USA）を加えたdigestionbuffer（10 mM Tris（pH7.5）（Trizma-base，SIGMA-ALDRICH，MU，USA），300 mM NaCl，5 mM EDTA（pH8.0））を加え30℃，60分間で処理し，その後SDS-proteinase K 液（8 % SDS， proteinase K（TAKARA，東京））を加え37℃，30分でRNaseを不活化した．その後フェノール：クロロフォルム抽出を行い，キャリアとしてtRNAを加え，エタノール沈殿を行った後，Gel-loading buffer （95 % Formamide， 5 mM EDTA（pH8.0），0.025 % BPB，0.025 % XC，0.025 % SDS）を加えペレットを溶解し，95℃ 5分でdenatureを行い氷冷した後，8Mの尿素（SIGMA-ALDRICH，MU，USA）を含む5 ％ポリアクリルアミドゲルにアプライし300V，70分間，電気泳動を行った．その後ゲルドライヤー（Gel dryer ： 583，BIO-RAD，Ca，USA）を用いて200℃，1時間乾燥させ，Mac Bas 1500イメージリーダー（FUJIFILM，東京）に1時間感光させ，バイオイメージングアナライザーBAS 1500（FUJIFILM， 東京）を用いて画像を読み込み，さらにバイオイメージングアナライザーMac BAS（Ver.2.3， FUJIFILM，東京）を用いて画像を取り込み，バンドを確認し定量を行った．その後，フィルムに当て−80℃で10時間感光させ現像し，Scion Image（Beta 4.0.2，Scion Corporation，MD，USA）にて再度定量を行った．

　測定値はすべて平均値±標準誤差で表し，統計解析は，血圧についてはTwo-way analysis of varianceを用いて群間比較を行った後，Scheffe's F testを行った．また血中ホルモンの変化，ACE mRNAの変化についてはOne-way analysis of varianceを用いた後，Scheffe's F testを行った．p＜0.05を統計学的に有意差ありとした．実験2のHUVECにおけるACEmRNAの発現についてはそれぞれの実験を5回行い，その発現を定量化したのちOne way analysis of varianceを用いて群間比較を行った後，Scheffe's F testを行った．p＜0.05を統計学的に有意差ありとした．なお，ACEの発現量の測定値は，EF1αの測定値で除して算出した．統計解析のソフトにStatview Ver.IVを用いた．

実験　1.　SHRの血圧上昇機序におけるE₂の役割
血圧の変化
　SHRの血圧は16週齢，18週齢では3群間で有意な差を認めなかったが，20週齢からOVX群でC群と比較して有意に増加した（ 20週齢：Control vs．OVX：167±3 vs．175±3 mmHg，p＜0.05）， （22週齢：Control vs．OVX ：171±4 vs． 181±5 mmHg，p＜0.05）．またOVE群では血圧の増加はほぼC群と同レベルであり，E₂の補充により血圧の上昇が抑制された（ 20週齢：OVX vs．OVE：175±3 vs．166±3.5 mmHg，p＜0.05 ），（22週齢： OVX vs．OVE ：181±5 vs． 168±3.5 mmHg，p＜0.05 ）．（Fig. 1）
血中生理活性物質の変化
　20週齢時の断頭採血によるE₂濃度は対照群（n＝10， 20.75±1.8 pg/ml ），OVX群（n＝10，5.2±0.7 pg/ml，p＜0.01 vs． C群），OVE群（n＝10，41.5±4.4 pg/ml，p＜0.01 vs． C群）で卵巣摘出によるE₂の低下と，E₂-pelletによるE₂の補充を確認した．PRAの変化はC群，OVX群およびOVE群の3群間で明らかな差を認めなかった（C群（n＝10）：6.23±1.62，OVX群（N＝10）：7.45±1.29，and OVE群（n＝10）：8.65±3.21 ng/ml/hr）．ACE活性の変化はC群と比較してOVX群で有意に上昇し（C群（n＝8） vs． OVX群（n＝8） ：9.3±3.3 vs． 24.7±3.4 IU/l/37℃，p＜0.01），さらにE₂補充により，その上昇は有意に抑制された（OVX群（n＝8） vs. OVE群（n＝5）： 24.7±3.4 vs. 3.7±3.3 IU/l/37℃，p＜0.01）．AngIの変化はC群とOVX群の2群間では有意な差を認めなかったが（C群（n＝10） vs. OVX群（n＝10）： 4480±1636 pg/ml， vs. 4200±673 pg/ml），OVE群ではC群と比較して有意な上昇を認めた（n＝10， 8066±901 pg/ml，p＜0.01）．AngIIの変化は，C群と比較してOVX群で有意に上昇したが（C群（n＝7） vs．OVX群（n＝8）：424±45， vs． 620±51 pg/ml，p＜0.05），E₂補充により有意に減少した（OVX 群（n＝8）vs． OVE 群（n＝8）：620±51 vs． 384±64 pg/ml，p＜0.01）．（Table 1）
腎臓におけるACE mRNAの発現変化
　SHRの腎臓でのACE mRNAの発現の変化を比較したところ，C群と比較してOVX群で有意に増加し（Control vs. OVX： 0.91±0.33 vs． 1.00， p＜0.05），さらにE₂補充により，その上昇は著明に抑制された（OVX vs. OVE：1.00 vs． 0.853±0.38， p＜0.05）．（Fig. 2）
実験　2．HUVECでのACE発現に関する実験
　HUVECでのACE mRNAの発現は，E₂添加後，徐々に減少し添加前に比し，6時間後：0.757±0.065， 12時間後：0.343±0.107，18時間後：0.732±0.047，24時間後：0.864±0.088 と12時間をピークに著明な発現の減少を示した（Fig. 3）．
　E₂添加12時間後のHUVECでのACE mRNA発現の抑制は，コントロール（1 ACE/EF1α index）と比較して，10^-9Mで0.83±0.07，10^-8Mで0.49±0.05，10^-7Mで0.22±0.09とE₂濃度依存性にその発現を抑制した（Fig. 4）．
　E₂（10^-7M）投与によるHUVECでのACE mRNAの発現の抑制は，選択的エストロゲン受容体モジュレーター （selective estrogen receptor modulator：SERM）であるtamoxifen（10^-6M）を投与することで，コントロール（1 ACE/EF1α index）と比較し，E₂添加によりACE mRNAの発現は0.445±0.135まで抑制されたが，tamoxifenを添加により0.89±0.029までその発現が増加した（Fig. 5）．
　さらに，HUVECにAngII（10^-6M）を添加した結果，ACE mRNAの発現は，コントロール（1 ACE/EF1α index）と比較して，1時間後に1.081±0.177， 2時間後に1.36477±0.269， 3時間後に1.553±0.497， 4時間後に1.212±0.358とE₂の作用とは反対に，AngII添加によってACE mRNAの発現は3時間をピークに増加した（Fig. 6）．
　またAngII添加3時間後のHUVECでのACE mRNA発現の増加は，コントロール（1 ACE/EF1α index）と比較して，10^-8Mでは1.169±0.067， 10^-7Mでは1.294±0.08， 10^-6Mでは1.496±0.083とAngII濃度依存性にHUVECでのACE mRNAの発現を増加させた（Fig. 7）．

　今回の我々の検討では，SHRにおいてOVXに伴い血圧が上昇し，OVEでは血圧は上昇しないことを認めた．この変化は血中E₂レベルの変化に呼応していた．検索したRAS系の各成分で，PRAはOVXおよびOVEによる影響を示さなかったが，ACE活性はOVXにより上昇し，逆にOVEにより低下を認めた．AngIIは，ACEの変化を反映してOVX群で増加し，OVE群では抑制された．腎でのACEの発現も，OVX群で減少を認め，OVEで増加を認めた．
　HUVECを用いた実験で，E₂添加12時間後にACEの発現の抑制を認め，E₂濃度依存性に抑制された．このE₂添加によるACEの発現の抑制は，tamoxifenを同時に投与することで回復させることができた．またAngIIを添加したHUVECでは，添加1時間後からACEの発現の増加を認めた．その発現の増加は3時間後まで認められ，AngII濃度依存性に増加することを認めた．
　E₂は，女性ホルモンとして内外性器の発育のみならず，乳房，中枢神経，代謝系などに対する性器外作用も有しており，とくに閉経後の骨粗鬆症の改善^26），抗高脂血症作用^27-32）および抗酸化作用^33-39）による抗動脈硬化作用または心血管系疾患の予防などの効果が期待されている．しかしホルモン補充療法（HRT）の効果^40-44）については，1998年の無作為介入試験のHeart and Estrogen/progestin Replacement Studey（HERS）^45-48）で，その副作用である子宮内膜癌，乳癌および静脈血栓症などの合併症のリスクが明らかになり^47,49,50），その是非については様々な意見が報告され，長期のホルモン補充療法の有効性については現在まだ結論は出ていない．
　E₂は高血圧に対し抑制的に作用するといわれており^41,42），血管拡張作用，一酸化窒素（NO）^51-56）およびプロスタグランジンの増強作用^{12,52,55-58）}などが報告されている．しかし，RASへの影響に関しては，ATGの肝での産生については増加することでいくつかの報告は一致しているが，その他reninおよびACEへの影響については未だ一定の結論には達していない．
　ATGに関しては，The Stanford Five City Project においてATGの基質となるApo A-I値が男性と比較し女性で有意に増加しており，また閉経前後でのE₂補充療法によりApo A-I値の有意な増加を認めたことを報告している^30）．Klettらは，SDラット肝でのATGを血清およびmRNAレベルで比較検討したところE₂はATGの発現を増加させ，アンドロゲンはATGに変化を与えず，またhepatocyteやhepatoma cellでも同様にE₂で増加し，アンドロゲン投与では変化を認めなかったと報告している^7）．またATGの発現は組織特異性があり発現量や時間経過は各臓器で異なると報告されている^59）．肝にはE₂受容体（ER）が存在しており^3-5），またFeldmerらはATG遺伝子上流には，ER結合部位（ERE）が存在することを報告している^6）．従って，過剰のE₂服用時には血圧の上昇が認められることが報告されており，ピル服用時の血圧上昇の機序はATG産生亢進によるものと考えられている．
　今回の我々の実験では，ATGを直接的には測定していないが，PRAのレベルがOVXおよびOVEによって影響を受けなかったにもかかわらず，PRAの作用により変換されたAngIのレベルがOVE群でのみ増加を認めており，E₂の作用によりその基質であるATGの産生が増加していたことを，間接的ではあるが，支持することができた．
　PRAに対する影響については一定の見解は得られていない．その遺伝子上流に（ERE）の存在が報告されており^8），E₂の関与が示唆される．しかしBrosnihanらは，cynomolgus monkeyで，OVX後のE₂補充によりPRAの上昇を認めたと報告している^9,10）が，反対にSharkeyらは，SHRを用いた実験でOVX後の血圧の上昇を経皮E₂投与により抑制できたが，これと相関関係が認めたのはACE活性だけであり，ATGおよびPRAには影響を与えなかったと報告している^12）．またSchunkertらは，ヒトでの閉経後のHRTはATGを増加させたが，反対にPRAを減少させたと報告している^11）．今回の我々のSHRを用いた実験の結果では，OVXによるPRAの増加は認められなかったが，PRAが亢進しているSHRの場合では，その活性に対するE₂の影響が少ない可能性が推測された．
　ACE活性に及ぼすE₂の作用として，Proudlerらは，ヒトでのHRTはACE活性を抑制させることができると報告している^60）．動物モデルでもE₂が血清および各臓器のmNRAレベルでのACE活性を抑制し，AngIIの産生を抑制させるとの報告があり，E₂によりATGやPRAが亢進した状態でも，ACE活性の抑制と血管拡張作用物質であるAng-（1-7）を増加させることで，血圧の上昇を抑制していることが報告されている^{9,10,16,61）}．しかし，Schunkertらは，ヒトでの閉経後のHRTによって，ATGの増加およびPRAの抑制は認めるが，ACEの活性には影響を与えなかったと報告しており^11），ACEに対するE₂の作用については未だ一定の見解が得られていない．HubertらのヒトACEの上流解析の結果から，少なくとも−1484までの間には典型的なEREは確認されておらず^13-15），遺伝子レベルでのE₂の関与についても明らかとなっていない．しかしE₂と結合したERは，AP-1を介してAP-1 response elementに結合し，ERがERαの場合は遺伝子の発現を亢進させ，反対にERβの場合では発現を抑制することが報告されている^62）．さらにACEの遺伝子上流にはAP-1 site^63,64）に類似した結合部位の存在を認めているため^13），ACEプロモーター領域へのERの結合性について直接には確認されていないが，E₂がACE発現を抑制する仮説として，E₂がERβを介し，さらにAP-1を介した機序によってACEの発現を抑制している可能性が考えられた．
　今回の我々のSHRを用いた実験で，OVXによりACE活性の上昇をOVEによりその抑制を認めており，従来報告されているACE抑制作用と同様の結果となった．HUVECを用いた実験では，E₂によるACE mRNAの発現の抑制を tamoxifen により回復させることができたことから，E₂はERを介し直接ACE mRNAの発現を抑制することで，ACE活性を抑制させる作用があることを示唆した．
　E₂のAngII受容体（AT1）に対する影響としては，E₂はラットの下垂体前葉でのAT1受容体発現を抑制したり^17），また血管内皮細胞や平滑筋細胞でのAT1受容体発現を抑制することが報告されているが^65），まだ明確には解明されてはいない．
　またAngIIによるフィードバック機構として，AT1受容体を介し PRA を抑制するとの報告があるが^66），ACEに関しての報告はほとんど認められていない．今回の我々の実験では AngII が ACE mRNA の発現を増加させることを認め，AngIIとACE間でのpositive feedbackが存在する可能性を示した．
　これまでの報告によれば，腎臓はACEが多く存在する組織であり，ACEは全身ならびに腎臓の血行動態の調節を行っていることが知られている．腎臓のACEは血管内皮，さらに近位尿細管に発現することが報告されており^67,68），特に血管内皮のACEについては重要な全身のレニン−アンジオテンシン系の調節因子であることが報告されている^67）．一方尿細管におけるACEについては，腎臓のキニン−カリクレイン系の調節を行っているとの報告もあるが，現在のところその役割については明らかでない．今回の我々の検討では，腎臓全体でのACEmRNAの発現を検討した．この変化は，血中ACE活性ならびにAngiotensin II濃度と一致したことから，血管内皮におけるACE活性を反影しているものと考えられる．しかし，尿細管におけるACE活性の発現に関しても影響している可能性はあり，今後酵素抗体法やin site hybridyzatio法を用いたACEの発現部位，さらにその活性変化についても検討してゆくことが必要と思われる．
　今回の我々のSHRを用いた実験で，OVXによりACE活性の上昇をOVEによりその抑制を認めており，従来報告されているACE抑制作用と同様の結果となった．HUVECを用いた実験では，E₂によるACE mRNAの発現の抑制をtamoxifenにより回復させることができたことから，E₂はERを介し直接ACE mRNAの発現を抑制することで，ACE活性を抑制させる作用があることを示唆した．
まとめ
1. SHRでは，卵巣摘出により血圧は有意に上昇（OVX群）したが，E₂の補充により血圧上昇は抑制された（OVE群）．
2. SHRでは，卵巣摘出によりACE活性は有意に上昇（OVX群）したが，E₂の補充によりACE活性上昇は抑制された（OVE群）．
3. SHRでは，卵巣摘出によりAngIIは有意に上昇（OVX群）したが，E₂の補充によりAngII上昇は抑制された（OVE群）．
4. SHRでは，卵巣摘出により腎臓でのACE mRNAは有意に上昇（OVX群）したが，E₂の補充により腎臓でのACE mRNA上昇は抑制された（OVE群）．
5. HUVECでのACE mRNAの発現は，E₂添加12時間後に減少を認めた．
6. HUVECでのACE mRNA発現は，E₂濃度依存性に抑制された．
7. E₂投与によるHUVECでのACE mRNAの発現の抑制は，tamoxifenを同時に添加することで回復させることができた．
8. HUVECでのACE mRNAの発現は，AngII添加後3時間をピークに増加した．
9. HUVECでのACE mRNAの発現は，AngII濃度依存性に増加した．

　今回我々は，SHRの血圧上昇機序におけるE₂の作用をin vivoおよびin vitroの系から検討を行った．OVXはSHRのACE活性を亢進させ，血圧を有意に上昇させた．一方E₂の補充は，ACE活性を抑制し血圧低下をもたらした．次いでE₂の直接的なACE活性に及ぼす作用を明らかにするために，HUVECを用いた実験を行った．その結果，ACE mRNAの発現はE₂添加12時間後に抑制され，濃度依存性に抑制された．またこの発現の抑制は，tamoxifenを同時に添加することで回復させることができた．従ってエストロゲンは内皮細胞に直接作用してACE mRNAの発現を抑制し，RASを抑制することで血圧の上昇を抑制していることが明らかとなった．以上の結果から，E₂はACE活性を減少させ，それに伴いRASの抑制をもたらすことにより血圧の低下をもたらしていることが示唆された．

　稿を終えるにあたり，御指導御校閲を賜わりました埼玉医科大学腎臓内科鈴木洋通教授，中元秀友助教授ならびに教室員各位，同大学分子生物学教室禾奏寿教授，久武幸司助教授，折茂彰講師に深謝いたします．この研究の一部は第2回日本心血管内分泌代謝学会（1998京都），第72回日本内分泌学会総会（1999横浜），第23回日本高血圧学会総会（2000福岡）において発表した．

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