埼玉医科大学雑誌

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Thesis

皮膚エリテマトーデスと全身性エリテマトーデスにおける円板状紅斑の異同に関する研究
－免疫組織化学的検討を中心として－

大澤　絵麻

埼玉医科大学皮膚科学
（指導：土田　哲也教授）

医学博士　甲第810号　平成14年3月22日（埼玉医科大学）

Studies on a Dissimilarity of Discoid Lesions of Cutaneous-limited Lupus Erythematosus and Those of Systemic Lupus Erythematosus
Ema OSAWA (Department of Dermatology, Saitama Medical School, Moroyama, Iruma-gun, Saitama 350-0495, Japan)

To know the difference between discoid lesions of systemic lupus erythematosus(SLE) and those of cutaneous lupus erhthematosus(CLE), clinical, histopathological and immunohistiochemical studies were performed. Specimens of skin were obtained from 5 patients of CLE, 5 patients of SLE with discoid lesions, 5 patients of SLE with butterfly rash and 5 patients of Sjögren’s syndrome (SJS) with annular erythema. Immunohistochemical analysis was studied using monoclonal antibodies to CD4, CD8, CD95, CD3, CD45RA, CD45RO, TCRγδ, CD44, HLA-DR and CD20. The clinical difference between discoid lesions of SLE and those of CLE was the size, the number of discoid lesions, the extent of exudation, and the complication of other form of skin lesion. The histological difference between discoid lesions of SLE and those of CLE was the density and extent of infiltrating cells. The infiltrating cells of discoid lesions of CLE were densely observed compared with those of SLE. Between those lesions no obvious difference was seen in infiltrating cells stained with anti-CD4 and CD8, but CD4 expression was prominent in the discoid lesions of SLE. Although CD95 was expressed in the infiltrating cells and epidermis at discoid lesions of CLE and SLE, the infiltrating cells in SJS showed negative. This finding was thought to be the difference between LE groups and SJS. CD45RO expression was dominant compared with CD45RA expression in all lesions, and no difference was seen between CLE and SLE. It was concluded that some difference between discoid lesions of SLE and those of DLE was observed clinically, histopathologically, but it was not obvious immunohistol ogically.
Keywords: CLE, SLE, discoid lesion, CD4, CD8, CD95, CD44, HLA-DR, CD45RO, CD45RA

　I．緒　言

　1990年，土田らは，エリトマトーデスlupus erythematosus（LE）の分類に関連し，全身症状からつける診断名と皮膚症状に対する皮疹名により，二次元的に評価する病型分類を提唱した（図1）．そのうち診断名の分類には，皮膚限局性であるcutaneous-limited LE（CLE）と，SLEともCLEともいえない中間型のintermediate LE（ILE），およびSLEがある．円板状紅斑（DLE型紅斑，discoid lesion）は，これらCLE，ILE，SLEのにいずれにおいてもみられる^1-3）．しかしそれぞれにおいてみられる円板状紅斑の異同についてはいまだ明らかにされていない．
そこで，今回，CLEとSLEにおける円板状紅斑の異同を明確にするために，免疫組織化学的分析を中心に臨床的，病理組織学的にも検討した．その他，SLEの蝶形紅斑，シェーグレン症候群 Sjögren’s syndrome（SJS）の環状紅斑，正常皮膚についても検討を加えた．

　II．材料と方法

1．患者と組織
　患者は埼玉医科大学付属病院皮膚科において1996年以降に訪れた20名の患者である．CLEの円板状紅斑が5例，SLEの円板状紅斑が5例，蝶形紅斑が5例，シェーグレン症候群（以下SJS）の環状紅斑が5例および，正常皮膚が1例で，すべて顔面より皮膚生検にて組織検体を得た．なお，SLEの症例はいずれも1982年のアメリカリウマチ協会（ACR）の診断基準に基づいて診断した．シェーグレン症候群の症例は1993年のACRの診断基準に基づいて診断した．　
2．免疫組織化学
　ホルマリン固定，パラフィン包埋した材料から切片（3～4 μm ）を作成し，免疫染色はavidin-biotin peroxidase complex（ABC）法で行った．使用した抗体は，抗CD3抗体（ DAKO, code No. M7193 希釈倍率1:10），抗CD4抗体（ Novo castra, code No. 297343, 1:20），抗CD8抗体（ Novo castra, code No. 297342, 1:40），抗CD44 抗体（ DAKO, code No. M7082, 1:50），抗CD20抗体（ Novo castra, code No. 280054, M 1:200），抗CD45RA抗体（ DAKO, code No. M0574），抗CD45RO抗体（ DAKO, code No. M0742, 1:40），抗CD95抗体（DAKO, code No. M3553, 1:8），抗HLA-DR抗体（ Neo Markers, code No. #MS-133-P1, 1:50），抗Pan TCRγδ抗体（ ENDGEN, code No. EN-4506-10, 1:5）の10種類であり，全てマウスモノクローナル抗体である．
　前処理として抗CD4抗体については，抗原賦活液（ダイアヤトロン社）に入れ，オートクレーブ処理した（121℃，10分間）．抗CD3抗体はS-3308（DAKO社），抗CD44抗体はS-2031（DAKO社）を抗原賦活化液として用いてマイクロウェーブ処理を行った．またCD95抗体についてはトリプシン（0.1％トリプシン溶液，37℃，30分間処理）による消化を加えた．
　免疫染色はまず切片を脱パラフィン後PBSで洗浄し，ブタ血清を加えて20分間放置した．次にそれぞれの1次抗体を反応させた（12時間，室温）．その後，PBSで洗い，0.3％H₂O₂メタノール溶液中で10分間，内因性ペルオキシダーゼの処理を行った．最後にPBSと蒸留水で洗浄後にDAB反応を行った．
3．免疫組織標本の評価方法
　表皮，付属器，血管および浸潤細胞について，おのおのその陽性所見の範囲，及び染色の強度により下のように分類し，両者の組み合わせによって評価を行った．
（1）陽性所見の範囲を0～3に示す．
　　　0：染まっていないもの
　　　1：1～30％の範囲で染まっているもの
　　　2：30～70％の範囲で染まっているもの
　　　3：70～100％の範囲で染まっているもの
（2）さらに染色の強度について－～＋＋＋により示す．
　　　　－：陰性
　　　　± ：弱陽性
　　　　＋：中等度の陽性
　　　　＋＋：中等度から強陽性
　　　　＋＋＋：強陽性

　III．結　果

1．臨床的所見（表1）（図2）
　表1に円板状紅斑を有するCLE 5症例，円板状紅斑を有するSLE 5症例の臨床的特徴を示す．平均年齢は，CLEが45.8歳，SLEが32.8歳であった．男女比は，CLEは3:2，SLEは，1:4であった．皮疹の分布から，頸部より上にのみ円板状紅斑があるものを限局型，頸部より下にも円板状紅斑が存在するものを播種状型として分類した．CLEでは限局型4例，播種状型が1例，一方，SLEでは限局型1例，播種状型4例で，CLEでは限局型，SLEでは播種状型が優位であった．皮疹数はCLEでは単発から多発まで分かれたが，SLEでは4例が多発であった．大きさではCLEでは，大型のものが3例あり，中型と小型のものが，それぞれ1例であるのに対し，SLEでは5例全てが小型のものであった（図2）．滲出傾向は，CLEでは，1例が（±），4例が（－）であったが，SLEでは全例に滲出傾向がみられた．他皮疹型並存は，CLEでは全症例が（－）であったが，SLEでは全例が（＋）であり，凍瘡様皮疹が2例，凍瘡状LEが1例，蕁麻疹様紅斑が1例，SCLE型皮疹（丘疹鱗屑型）が1例であった．
2．病理組織学的所見（表2）（図3）
　CLEとSLEにおける円板状紅斑の組織学的特徴を，表2にまとめた．両者間での大きな差異は，血管周囲および付属器周囲におけるリンパ球浸潤の程度ならびに，浸潤の認められる深さであった．CLEにおいては，SLEにおける円板状皮疹に比し，明らかに浸潤が密で，深部にまでおよんでいた（図3）．
3．免疫組織化学的所見（表3－5）
1） CD4（図4）
　SLEにおいては円板状紅斑と蝶形紅斑の全ての症例で，浸潤細胞は3/＋であった．一方，CLEでは浸潤細胞1/＋が5例，SJSでは5例全て浸潤細胞1/＋，といずれもSLEに比べ陽性浸潤細胞の割合が若干低い傾向がみられた．
2） CD8（図5）
　CLEの円板状紅斑は浸潤細胞3/＋＋が5例であった．浸潤細胞はCD4に比し，CD8優位の染色結果であった．一方，SLEの円板状紅斑では浸潤細胞1/＋＋が5例，蝶形紅斑では浸潤細胞1/＋＋が5例，といずれもCLEに比べ陽性の割合が低かった．SLEの紅斑ではいずれにおいてもCD8に比べCD4陽性細胞が優位であった．SJSでは4例で浸潤細胞1/＋，1例で3/＋でありCD4に比べると陽性率が高かった．
3） CD3
　CLE，SLE，SJSのいずれの紅斑においても浸潤細胞は1/＋～＋＋＋でこれらの群の間に差はみられなかった．
4） CD95（図6）
　CLEの円板状紅斑，SLEの円板状紅斑，蝶形紅斑のいずれにおいても程度の差はあるが，表皮全層，付属器，浸潤細胞に陽性所見がみられた．ただし，SLEの円板状紅斑と蝶形紅斑においては1例ずつ浸潤細胞0/－であった．一方SJSの環状紅斑においては1例を除き浸潤細胞にはほとんど発現はみられなかった．すなわち，CLEとSLEの各々の皮疹の間には大きな差はみられなかったが，この両者を含めたLE群とSJSの間で明らかな差が認められた．
5） TCR γδ
　CLEの円板状紅斑において浸潤細胞1/＋＋陽性が1例，1/＋が3例，0/－が1例，SLEの円板状紅斑1/＋が1例，1/±が4例でほとんど差はみられなかった．しかし，SLE蝶形紅斑の浸潤細胞では，1/＋＋陽性が3例，1/＋陽性が2例で，円板状紅斑に比べ染色強度が高くみられた．
6） CD45RA
　CLEとSLEの円板状紅斑，SLE蝶形紅斑の浸潤細胞は1～0/＋～－で，範囲および強度とも低く，LE群の間に差はみられなかった．
7） CD45RO
　CLEとSLEの円板状紅斑，SLE蝶形紅斑，SJS環状紅斑の浸潤細胞は1～2/±～＋＋＋で，これらの間に差はみられなかった．しかし，浸潤細胞においてCD45RAに比し発現は，どの群でも高くみられた．
8） CD44（表4）（図7）
　CLEとSLEの円板状紅斑，SLEの蝶形紅斑では，表皮細胞間，付属器，浸潤細胞に陽性がみられたが，表皮においてはCLEの円板状紅斑に比して，SLEの円板状紅斑，蝶形紅斑のほうが強く発現していた．
9） HLA-DR（表5）
　CLEとSLEの円板状紅斑，SLE蝶形紅斑，SJS環状紅斑では，表皮0～1/－～＋，浸潤細胞0～1/－～＋＋で，これらの間に差は無かった．
10） CD20
　CLEとSLEの円板状紅斑，SLE蝶形紅斑，SJS環状紅斑は，浸潤細胞が1/＋～＋＋でこれらの間に差はみられなかった．

　IV．考　察

　CLEとSLEにみられる円板状紅斑の異同を明らかにすることはLEの診断及び治療方針の決定において重要な意味をもつ．
　まず臨床的に検討したところSLEにみられる円板状紅斑はCLEに比べ，1）滲出傾向がある，2)小型の紅斑，3）頸部から下にも存在する，4)他の皮疹型の並存がみられる，といった傾向がみられた．これらの特徴は従来，私共が感じていた臨床的差異に一致する．
　次いで組織学的に検討したところ，両者の大きな差異は，血管周囲および付属器周囲における細胞浸潤の強度ならびに浸潤の深さであった．CLEにおける円板状紅斑は，SLEにおける円板状紅斑に比し，浸潤が密であり，深部にまでおよんでいた．この特徴はCLEの円板状紅斑とSLEの蝶形紅斑の差異として認められていた点であり，SLEの円板状紅斑はより蝶形紅斑の組織像に近い特徴を有するということもいえる．
　そこで，CLEとSLEでの円板状紅斑をさらに免疫組織学的に検討し，より客観的にその異同を評価することを目的に，その浸潤細胞ならびに表皮の染色態度を比較，検討した．
　CD4染色とCD8染色ではSLEの円板状紅斑においては，CD4染色が優位であるのに対して，CLEにおいてはCD8染色がより優位であった．この結果に関しては，CLEの円板状紅斑において，同一の見解を示す報告⁴⁾と，逆にCD4が優位である報告^{5,6
)}がみられる．CLEとSLEでは全身的な免疫異常については大きな差があるが，皮膚病変形成の最後の段階で共通のプロセスにいたることより，類似の皮膚病変を形成することが推測される．CLE，SLEにおける浸潤細胞のCD4/CD8比の違いは，自己抗体産生が顕著なSLEに対して自己抗体産生は少ないが，瘢痕形成をきたす強い皮膚症状を呈するCLEというそれぞれの臨床症状に関連している可能性もある．
　SLEではアポトーシスの抑制ならびに促進に基づく病態が存在している．Fas依存性アポトーシスの促進に関しては， FasおよびFas L遺伝子発現の亢進，FasL陽性T細胞の増加，さらにアポトーシス抑制分子FAP-1の遺伝子発現低下の報告がある⁷⁾．これらは，Fas依存性アポトーシスの促進因子となりうる．Fas ligandのligationの受容体であるCD95は，Fas発現細胞のアポトーシスを引き起こす．既報告例では，CLEとSLE の円板状紅斑において表皮と浸潤細胞に同様にCD95陽性所見が認められている⁸⁾．今回，SLEとCLE間でCD95染色について浸潤細胞の反応性に差がみられなかったものの，SJSとの相違は注目された．自然消退が起こりにくいLEの皮疹と自然消退するSJSの皮疹の病態を考える上で示唆に富む．
　CD45RA染色ではCLEとSLEの円板状紅斑ともに浸潤細胞の染色強度が弱い結果であった．CD45ROではCLE，SLEともに浸潤細胞が，強陽性であったが，差は認められなかった．CD45RA染色よりもCD45ROのほうが，強い染色性を示すという結果は，以前の報告と同じであり^9），細胞活性化との関連が考えられる．
　TCRγδに関しては，SLE患者の末梢血中の白血球のTCRγδの発現は，正常者よりも低下しているとの報告^10）や，また，慢性の皮膚エリテマトーデスにおいて，TCRγδの免疫染色では基底層付近の浸潤細胞や，真皮の浸潤細胞に発現があるとの報告がある^11）．今回の検討ではCLE，SLEの円板状紅斑に比べSLEの蝶形紅斑が浸潤細胞の陽性率，染色強度ともに高かった．γδT細胞が皮膚苔癬反応を抑制している可能性を示唆する報告^12）もあり，円板状紅斑に比べリンパ球浸潤が少ないSLEの蝶形紅斑で陽性率が高いことは注目される．なお，CD45RAやCD45ROならびにTCRγδのT cellの表面マーカーが，表皮と付属器に陽性に認められたことについては，トリス塩酸緩衝生食水の塩濃度，室温の影響などによる，非特異的な反応が加わった可能性は否定できない．
　Harrisらは，CD44が正常皮膚においては表皮と線維芽細胞，血管に強い染色性を示し，DLEでは表皮全体に均一に染色され，リンパ球は強陽性に染まると，報告している^13）．末梢血中のCD44リンパ球の活性化は，SLE，慢性関節リウマチの自己免疫疾患の活動性の指標となるという報告がある^14）．今回のCD44染色では，CLEとSLEの円板状紅斑は表皮細胞間も染まり，浸潤細胞と付属器を含めて両者の差は認められなかった．蝶形紅斑，SJSも同様であった．CD44がこれらの皮疹において正常に比べより強く発現することと表皮病変との関連も考える必要があるが，表皮に変化を示さないSJSの環状紅斑でも陽性のため意義は不明といわざるをえない．
　既報告例を調べえた限り，CLEとSLEの円板状紅斑での異同について免疫組織学的な検討をした報告は無く，本論文が始めてのものと思われる．今回おこなった免疫組織化学的な検討からは，CLEとSLEの円板状紅斑との間では染色の強度，陽性範囲の両者で，一部に差がみられたものの大きな差異は認められないと考えられた．

　謝　辞

　本稿を終えるにあたり，御指導を戴いた埼玉医科大学皮膚科学教室土田哲也教授に深甚なる感謝の意を表します．また本研究にご協力戴いた同教室倉持朗講師に深謝いたします．

　文　献

1) 土田哲也，盛岡奈緒子，上田純嗣，大路昌孝，飯島正文，石橋康正，他．エリテマトーデスの診断と皮疹名．皮膚臨床 1990;32:1139-49.
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