Thesis
モノクロタリン心不全ラットの心室筋細胞における細胞内Ca調節

小川　晴美
埼玉医科大学　大学院　臨床医学系　循環器内科学専攻
（指導：西村　重敬 教授）

医学博士　甲第1017号　平成18年3月24日 （埼玉医科大学）

Cytosolic Calicum Regulation in Ventricular Myocytes of Rats with Monocrotalin-Induced Heart Failure
Harumi Ogawa (Department of Cardiology Saitama Medical University, Moroyama, Iruma-gun, Saitama 350-0495, Japan)

　Monocrotaline (MCT) has been well known to induce pulmonary hypertension (PH) without changing systemic blood pressure in animal models. We previously reported that pathological hypertrophy occurred in left ventricle (LV) as well as in right ventricle (RV) with MCT-induced PH model although neither pressure or volume overload was burdened on LV. Our purpose is to examine differences in [Ca²⁺]i regulation between hypertrophic myocytes with pressure overload (RV myocytes) and those without pressure overload (LV myocytes). Our working hypothesis was that RV remodeling due to both direct mechanical overload and neurohumoral factors may have different effects on myocyte Ca²⁺regulation in comparison with LV remodeling solely due to neurohumoral factors. We injected MCT or control saline intraperitonealy and observed these rats for 6 weeks. We lost some of them due to pump failure or other complications. Ventricular myocytes were isolated enzymatically from RV and LV free walls 6 weeks after injection. We measured [Ca²⁺]i beat to beat basis using fluo-3 as previously reported. In stabilized electrically-activated [Ca²⁺]i transients, the peak systolic [Ca²⁺]i and the amplitude of [Ca²⁺]i significantly increased in LV myocytes of MCT rats as compared with LV myocytes of Sham rats or RV myocytes of MCT rats. The decline phase of [Ca²⁺]i transients were also accelerated in LV myocytes of MCT rats. But these parameters were not changed in RV myocytes of MCT rats in comparison with RV myocytes of Sham rats. Protein kinase activation of myocytes increased peak systolic [Ca2+]i but decreased the decline speed of [Ca²⁺]i transients in both LV and RV of MCT and Sham. The normalized [Ca²⁺]i transients decline speed was not associated with plasma brain natriuretic peptide level (a well known marker of heart failure grading).
　To examine whether these Ca²⁺handling changes were due to Ca²⁺handling gene expression, we performed RNAse protection assay for sarcoplasmic endoplasmic reticulum Ca ATPase (SERCA) and Na-Ca exchanger (NCX). These assays did not show significant changes in the expression of SERCA and NCX genes.
Thus the Ca2^+ahandling was altered in both LV and RV ventricular myocytes from MCT-induced rat hearts. But the data described above strongly suggested that the alterations of Ca²⁺handling in MCT rat hearts were not due to the changes in SERCA or NCX gene expression but due to the changes in SERCA and/or NCX functions. The mechanisms in alterations of SERCA and NCX function may involve phosphorylation state of these proteins.
Keywords: Monocrotaline, Congestive Heart Failure, Ventricular Remodeling, Calcium Handling, Fluo-3

Thesis
1型リアノジン受容体を介したヒト樹状細胞応答の解析悪性高熱症素因者診断のための可能性

成田　弥生
埼玉医科大学　医学部　麻酔学
（指導：菊地　博達 教授）

共同研究者： 植村　靖史，劉　天懿，松下　祥（埼玉医科大学医学部免疫学），菊地　博達（埼玉医科大学麻酔学教室）
医学博士　甲第1049号　平成19年3月23日 （埼玉医科大学）

　悪性高熱症 (malignant hyperthermia; MH) は，Ca²⁺チャネルの一つである1型リアノジンレセプター (ryanodine receptor type 1; RyR1) の変異に起因して，全身麻酔時に筋小胞体のCa²⁺動態異常を示すことにより発症する遺伝性筋疾患である．発症時には筋強直，発熱の他にも多様な症状を呈するため，世界的に統一された臨床診断基準は今のところない．現在，生検により得られた筋細胞のCICR (Ca²⁺induced Ca²⁺ release) を確定診断に用いているが，高度の侵襲性を有すること，検査時間が長いこと，施設の制限等により普及していない．したがって，侵襲性の少ない一般採血による検査が可能になれば，日常検査の一つとして広く応用することが出来る．
　樹状細胞 (dendritic cells; DCs) は末梢血中に存在する白血球の一つであり，種々の刺激に対して液性因子産生や細胞遊走，形態学的変化等，多様な細胞応答を示し，免疫制御において重要な役割を演じている．しかし，ヒトDCにおけるRyR発現を確認した報告は現在のところ無い．我々はこのDCに着目し，RyRサブタイプの発現およびRyRを介したCa²⁺応答性を解析した．その結果，DCはRyR1遺伝子を発現しており，そのRyRを特異的に刺激することで細胞内Ca²⁺ストアに由来するCa2+上昇を示した．また，このCa²⁺上昇はRyR阻害剤により抑制された．従って，DCにはCa²⁺チャネルとして機能するRyR1が存在し，これを介して特異的な細胞応答を示す可能性がある．DCはMH素因者を同定する新規診断法開発のために，RyR1応答を指標として患者と健常人の相違点を探索するのに有用である．
Keywords: 悪性高熱症，樹状細胞，リアノジン受容体

Analysis of Human Dendritic Cell Responses Mediated by Type 1 Ryanodine Receptor
-A Possible Diagnostic Tool for Malignant Hyperthermia-
NARITA YAYOI (Department of Anesthesiology, Saitama Medical University, Moroyama, Iruma-gun, Saitama 350-0495, Japan)

Thesis
Left Atrial Ejection Force：小児正常値と心疾患における変化

熊倉　理恵
埼玉医科大学　小児心臓科

医学博士　甲第1043号　平成18年3月23日 （埼玉医科大学）

背景：左心房の収縮によって発生する力(Atrial Ejection Force; AEF)は，高血圧患者の心室形態や機能，成人における心血管事故と関連することが示されている．しかしながらこれまで小児でのAEFに関する知見はいまだない．今回我々は，小児における左房AEFの正常値と心疾患における変化につき検討した．
対象と方法：心雑音，胸痛，不整脈疑いを主訴に来院し正常と判定された小児計61例(生後10日から18歳)を正常小児群とした．心疾患患者は，左室容量負荷疾患（心室中隔欠損9例，動脈管開存7例），左室機能低下疾患(拡張型心筋症3例)，左室圧負荷疾患（大動脈縮窄6例）を対象とした．AEFはNewton運動第2法則に基づき，0.5×ρ×僧帽弁口面積×(左室流入A波最大速度)2で求めた．心室中隔欠損術前では，連続の式において肺動脈流出波形を用いた．
結果：正常小児におけるAEFは，体表面積，心拍，一回拍出量係数により規定された（AEF＝ 4.134×BSA＋0.045×HR＋0.044×SVI－5.498，r＝0.78，p＜0.0001）．心室中隔欠損，動脈管開存では，肺血流増加に伴い，正常より有意に高値を示し，心房過収縮の状態であることが示唆された．一方，拡張型心筋症においては，AEFは正常より低値をとり，心室のみならず心房収縮も障害されていることが示唆された．大動脈縮窄は，AEFは高値を示し，後負荷増強に対する心房収縮性の心室同様の適応変化と考えられた．
結論：AEFは種々の小児疾患における心房収縮の観点からその病態に関する情報を提供しうる指標になる可能性がある．今後，臨床経過，予後との関連につき検討し，小児心疾患患者管理における指標としての意味づけをさらに深めるに値するものと思われる．
Keywords: AEF，左心房収縮，経胸壁心臓超音波

Rie Kumakura (Department of Pediatric Cardiology, Saitama Medical University, Moroyama, Iruma-gun, Saitama 350-0495, Japan)

Thesis
SYBR GreenＩを用いたWT1のReal Time PCR標準化曲線の立ち上げ
―SYBR Green法を用いた膵臓癌におけるWT1の発現解析等―

小田　慶太郎
埼玉医科大学　総合医療センター　外科

医学博士　甲第1029号　平成18年6月23日 （埼玉医科大学）

The establishment of standardized curve for Real Time PCR of WT1 using SYBR Green I
- To analyze WT1 expression in pancreatic cancer using SYBR Green I-
Keitaro Oda (Department of Surgery, Saitama Medical Center, Saitama Medical University, 1981 Tsujido-machi, Kamoda, Kawagoe-shi, Saitama 350-8550, Japan)

　Due to difficulties in early detection of pancreatic cancer as well as rapid progression of the disease, it is extremely difficult to completely resect the tumor surgically. The improvement of prognosis may be expected with chemotherapy and radiation therapy for the remaining cancer cells or post-op adjuvant therapy, but there still has not been any effective treatment.
　In recent years, tumor vaccine therapy using tumor antigen peptides are receiving attention. Especially, the WT1 antigen has been known to be expressed in many kinds of cancer, and is receiving attention as the possible universal vaccine for tumors. In Japan, promising results have been reported by H.Sugiyama et al for trial studies of treatment using tumor vaccine derived from WT1 based antigen peptides.
　In order for the vaccine treatment targeted against tumor antigens to be effective, one must confirm that the antigen is expressed by the targeted tumors. In general, when enough cancerous tissue from surgical excision or biopsy can be obtained, immunohistochemical staining is the standard method. On the other hand, in hematological disease and in tumors of difficult anatomic access, allowing only endoscopic or aspiration biopsies, one must rely solely on method utilizing molecular biology.
　The Real Time PCR has been known to be the method to quantitatively analyze the expression of mRNA in tissues and cells. Already, clinical laboratories have established the method to quantitatively analyze several of the protein expressions. Currently, the most common method adopted is Taqman. However, there are many problems with this method when using in research laboratories, since it is troublesome and its running cost is high. In this study, we established the Real Time PCR for WT1 expression, using the SYBR-Green method, which is easier and more cost effective than Taqman method. We then attempted to detect the expression of WT1 gene in clinical specimens of pancreatic cancer using this established method and showed the usefulness of our method.
Keywords: WT1, standardized curve of Real Time PCR, SYBR Green, Taqman, tumor antigen peptide, pancreatic cancer

Thesis
肋軟骨採取後の肋軟骨再生を目指した採取法の開発と家兎を用いた実験的研究

中島　康代
埼玉医科大学　医学部　形成外科学
（指導：中塚　貴志 教授）

医学博士　乙第1059号　平成19年6月22日 （埼玉医科大学）

　形成外科分野では，再建に肋軟骨を用いることがあるが術後の胸郭変形が問題となってきた．これを改善するために，軟骨膜を完全に温存し再建に用いた後の余剰肋軟骨を採取部に戻す（充填する）という新しい肋軟骨採取方法を行った．この方法に関し統計の取れた273例を対象として合併症の有無を検討した．結果は気胸と感染が1例ずつで胸郭変形は認めなかった．肋軟骨採取部位に軟骨が再生されたことで胸郭変形を防ぐことが出来たと考え，これを裏付けるために家兎を用いた実験を行った．家兎の肋軟骨を以下の方法で採取した．A. 肋軟骨膜を温存させるが余剰軟骨を充填しなかった群　B. 新しい採取法に準じて採取した群　C. 肋軟骨を膜ごと採取したコントロール群とし，それぞれ軟骨再生について検討した．Aでは石灰化を伴う軟骨再生像が得られた．Bでは充填した軟骨は生着し正常の肋軟骨様の組織が認められた．Cでは再生は全く認められなかった．この結果より，新しい肋軟骨採取法を用いるとほぼ正常の組織像を呈する軟骨が形成されることが証明された．以上より，新しい肋軟骨採取法は合併症を減少させうる方法と考えられた．