研 究
研究グループ/創造生理学グループ（三輪グループ）
プロジェクトテーマ

• 網膜の視覚情報処理
  
• プロジェクトメンバー
  　
  田丸文信
  平沢統
  青葉香代
  
  
• サブテーマ
  
  １）網膜アマクリン細胞の機能の解明
  （田丸文信、渡辺修一）
  ２）桿体双極細胞とAIIアマクリン細胞間のシナプス伝達の解析
  （田丸文信、青葉香代、渡辺修一）
  ３）哺乳類網膜に発現する多様な電位依存性Naチャネルの機能的意義の解明
  （金子優子、青葉香代、渡辺修一）
  4）ヒトiPS細胞，ヒトＥＳ細胞，マウスiPS細胞および，マウスES細胞を用いた網膜視神経細胞への分化誘導および創薬、再生医学研究への応用
  （田丸文信、渡辺修一）
  5）視覚情報処理における網膜抑制性回路の役割の解明
  （平沢統，渡辺修一）
  
  
• 概要
  
  １）網膜アマクリン細胞の機能の解明
  　　（田丸文信、渡辺修一）
  
  　哺乳類では、桿体視細胞からの光情報は、桿体双極細胞（ON型しかない）へ送られた後、AIIアマクリン細胞を介して錐体経路へ送られることがわかっています。この際、ON情報はAIIアマクリン細胞からギャップ結合を介して錐体経路のON経路へ、OFF情報はAIIアマクリン細胞からグリシン作動性シナプスを介して錐体経路のOFF経路へ送られます（図１）。以上のことは形態学的にわかっていることですが、AIIアマクリン細胞を介したON・OFF情報の振り分けや錐体経路への乗り換えなどのメカニズムについては、不明な点が多く残っています。
  　本研究室では、スライスパッチクランプ法を用いて、免疫組織化学法や薬理学的な解析と組み合わせながら、桿体経路におけるAIIアマクリン細胞の光情報処理機構を明らかにしていきたいと考えています。本研究室ではこれまで、AIIアマクリン細胞の電位依存性Naチャネルが細胞体とproximal dendrite付近に多く発現しており、そのNaチャネルを介して発生する小振幅の活動電位の頻度がグルタミン酸入力に応じて増加することを明らかにしました（Tamalu and Watanabe, 2007）。これらのことから、AIIアマクリン細胞の小振幅の活動電位の頻度は光情報をコードしていることが示唆されます。
  　また、AIIアマクリン細胞の小振幅の活動電位は、桿体経路から錐体OFF経路への乗り換え時のグリシン放出を増幅している可能性が高いと考えています。その理由として、（１）AIIアマクリン細胞はarboreal dendriteでギャップ結合を介してON型錐体双極細胞に出力していますが、ギャップ結合にはhigh-cutフィルターの性質があるために活動電位の振幅が大きく削られること、（２）AIIアマクリン細胞がOFF型錐体双極細胞およびOFF型神経節細胞にグリシン出力をしているproximal dendrite付近により多くの電位依存性Naチャネルが発現していること（Tamalu and Watanabe, 2007）、などが挙げられます。
  　今後は、AIIアマクリン細胞と双極細胞、あるいはAIIアマクリン細胞と神経節細胞からダブルパッチクランプ法で記録することによって、AIIアマクリン細胞の活動電位の役割について、より詳細に解析していく予定です。また、電気生理学的解析とCaイメージングとを組み合わせることで、AIIアマクリン細胞の活動電位とCa電流およびグリシン放出との関連を調べていこうと考えています。
  ２）桿体双極細胞とAIIアマクリン細胞間のシナプス伝達の解析
  　　（田丸文信、渡辺修一）
  
  　哺乳類網膜では、桿体視細胞は暗闇中で脱分極しグルタミン酸を放出しており、光が当たるとグルタミン酸放出が止まることが知られています。桿体視細胞からグルタミン酸入力を受け取る桿体双極細胞の樹状突起には代謝型グルタミン酸受容体が発現しており、グルタミン酸を受け取ることで過分極します。すなわち、桿体双極細胞は暗闇で過分極し、光で脱分極することがわかっています。AIIアマクリン細胞は、その桿体双極細胞からグルタミン酸入力を受けています（図１）。
  　本研究室の予備実験から、AIIアマクリン細胞の興奮性シナプス電流（EPSCs）の頻度は、室温の時よりも体温に近い温度で記録するほうが有意に高いことがわかりました。ところが、桿体双極細胞の代謝型グルタミン酸受容体のagonistを潅流投与した（擬似的に暗闇をつくった）状態で温度変化をさせても、AIIアマクリン細胞のEPSCsの頻度が変化しないことがわかりました。このことは、桿体双極細胞のグルタミン酸受容体が脱活性化している時にだけ温度依存性が表れることを示唆しています。すなわち、光によって桿体視細胞からのグルタミン酸放出量が減少し、桿体双極細胞の代謝型グルタミン酸受容体が脱活性化している時にのみ、そのグルタミン酸受容体とカップルしている陽イオンチャネルの開口確率が体温で高められ、最適なシナプス伝達ができるようになっている可能性が考えられます。
  　本研究室ではマウスの網膜スライス標本からパッチクランプ法で記録をし、上記のような薬物投与を行いながら記録中の温度条件を変えることで、桿体双極細胞とAIIアマクリン細胞間のシナプス伝達が体温で最適化されていることを解析しようと考えています。
  
  ３）哺乳類網膜に発現する多様な電位依存性Naチャネルの機能的意義の解明
  　　（金子優子、青葉香代、渡辺修一）
  
  （目的）
  　電位依存性Naチャネル（Na_V）は古くから研究されてきたチャネルであり、現在ではチャネルの構造と機能の関係もかなり理解が進んでいる分子である。Na_Vはαサブユニットとβサブユニットから構成され、それぞれサブタイプ（αサブユニット；Na_V1.1〜1.9、βサブユニット；β1〜β3）が明らかになっている。Na_Vは興奮性細胞における活動電位の発生と調節に深く関わり、近年ではその変異と疾患の関係が徐々に明らかにされつつある[for review, see Catterall et al., 2005] 。
  　一方、脳神経系の一部といえる網膜神経組織（図3-1）では、多様なNa_Vの局在とその機能的意義との関係はほとんどわかっていない。そこで、我々は、網膜組織に存在するNa_Vの分子生物学的同定を行い、電気生理学的な実験結果と合わせて網膜視覚情報処理におけるNa_Vの多様性の意義を明らかにしていくことを目指している。網膜においてNaVを機能的に発現している神経細胞は、アマクリン細胞の一部と神経節細胞であることが電気生理学的に明らかにされている。この中で神経節細胞については、Na_V1.1〜Na_V1.3、Na_V1.6が存在することが明らかにされている [Fjell et al., 1997] 。しかし、アマクリン細胞に存在するNa_Vのサブタイプはほとんどわかっていなかった。そこで我々は、活動電位発生型のアマクリン細胞に注目して実験を進め、in situハイブリダイゼーション法（ISH）法と免疫組織化学的手法を用いた二重染色により活動電位発生型アマクリン細胞の1つであるAIIアマクリン細胞には主にNa_V1.1が発現していることを初めて明らかにした（図3-1a,b,d）[Kaneko and Watanabe, 2007] 。現在は、やはり活動電位発生型アマクリン細胞であるドパミン作動性アマクリン細胞について調べている（図3-1c）
  。
  
  
  4）ヒトiPS細胞，ヒトＥＳ細胞，マウスiPS細胞および，マウスES細胞を用いた網膜視神経細胞への分化誘導および創薬，再生医学研究への応用
  　　（田丸文信、渡辺修一）
  
  　これまで，ヒトiPS細胞から軸索を持った網膜神経節細胞（視神経細胞）へ分化誘導することはできなかったが，国立成育医療研究センター眼科・視覚科学研究室との共同研究により，機能する軸索を持った視神経細胞を作ることに成功した(Tanaka et al., 2015)．また，マウスiPS細胞およびマウスES細胞からも同様に分化誘導することに成功した(Tanaka et al., 2016)．これにより治療法研究の選択肢が増えたことで，今後の創薬や移植による視覚回復治療に近づくと期待される．今後は、分化誘導した視神経細胞の軸索を誘導する薬物を検討する．
  
  
• 業績
  　
  (原著）
  2017年
  Tadashi Yokoi, Taku Tanaka, Matsuzaka Emiko, Fuminobu Tamalu, Shu-Ichi Watanabe, Sachiko Nishina, and Noriyuki Azuma. Effects of neuroactive agents on axonal growth and pathfinding of retinal ganglion cells generated from human stem cells. Scientific Reports 2017 Nov (7): 16757.
  
  Takashi Kozuka, Taro Chaya, Fuminobu Tamalu, Mariko Shimada, Kayo Fujimaki-Aoba, Ryusuke Kuwahara, Shu-Ichi Watanabe, and Takahisa Furukawa. The TRPM1 channel is required for development of the rod ON bipolar cell-AII amacrine cell pathway in the retinal circuit. The Journal of Neuroscience, 2017 Oct 37 (4): 9889-9900.
  
  2016年
  Taku Tanaka, Tadashi Yokoi, Fuminobu Tamalu, Shu-Ichi Watanabe, Sachiko Nishina, and Noriyuki Azuma. Generation of retinal ganglion cells with functional axons from mouse embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2016 Jun 57 (7): 3348-3359.
  
  金子優子*，青葉香代，菅理江．平成27年度学内グラント終了時報告書：網膜ドーパミン作動性アマクリン細胞の自発活動に関わるイオンチャネルの解明．埼玉医科大学雑誌 43:68-70 (2016)
  
  2015年
  Taku Tanaka, Tadashi Yokoi, Fuminobu Tamalu, Shu-Ichi Watanabe, Sachiko Nishina, and Noriyuki Azuma. Generation of retinal ganglion cells with functional axons from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports 2015 Feb 10 (5): 8344.
  
  2014年
  Koji Shibasaki, Kazuhiro Ikenaka, Fuminobu Tamalu, Makoto Tominaga, and Yasuki Ishizaki. A novel subtype of astrocytes expressing TRPV4 regulates neuronal excitability via release of gliotransmitters. The Journal of Biological Chemistry 2014 May 23; 289 (21): 14470-14480.
  
  2012年
  Yuko Kaneko, Kayo Fujimaki-Aoba, Shu-Ichi Watanabe, Shigeru Hokari, and Makoto Takada*. Localization of ENaC subunit mRNAs in adult bullfrog skin. Acta Histochemica 114:172-176 (2012)
  
  2011年
  Yuko Kaneko*, Rie Suge, Tomonori Fujiwara, Kimio Akagawa, and Shu-Ichi Watanabe. Unsual retinal layer organization in HPC-1/syntaxin 1A knockout mice. Journal of Molecular Histology 42:483-489 (2011)
  
  2007年
  Yuko Kaneko* and Shu-Ichi Watanabe. Expression of Nav1.1 in rat retinal AII amacrine cells. Neuroscience Letters 424: 83-88 (2007)
  
  Tamalu, F and Watanabe, S-I.
  Glutamatergic input is coded by spike frequency at the soma and proximal dendrite of AII amacrine cells in the mouse retina.
  Eur J Neurosci. 2007; 25: 3243-3252.
  
  2006年
  Chikafumi Chiba*, Akika Hoshino, Kenta Nakamura, Kanako Susaki, Yuka Yamano, Yuko Kaneko, Osamu Kuwata, Fumiaki Maruo, and Takehiko Saito. Visual cycle protein RPE65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology 495:391-407 (2006)
  
  （最近の学会発表）
  2016年
  XXII Biennial Meeting of the International Society for Eye Research: ISER2016
  Takashi Kozuka, Mariko Shimada, Fuminobu Tamalu, Taro Chaya, Shuhei Mikusa, Takahisa Furukawa. Role of TRPM1 channel in retinal circuit development
  
  第９３回日本生理学会大会
  Fuminobu Tamalu, Tanaka Taku, Yokoi Tadashi, Nishina Sachiko, Azuma Noriyuki, Shu-Ichi Watanabe. Functional and morphological differentiation of retinal ganglion cells from human iPS cells. The Journal of Physiological Sciences 66, Supplement 1, S129 (2016)
  
  第93回日本生理学会大会
  金子優子，青葉（藤牧）香代，渡辺修一．ラット網膜のドパミン作動性アマクリン細胞における電位依存性Naチャネルの発現パターン
  
  2014年
  TRP研究会2014「TRPチャネル研究を通じて見えてきた新たな生理学への光」田丸文信、渡辺修一. 網膜杆体入力型双極細胞におけるTRPM1チャネルを介したグルタミン酸放出の制御
  
  第９１回日本生理学会大会
  Fuminobu Tamalu, Shu-Ichi Watanabe. Mechanisms of synaptic transmission mediated TRPM1 channels between retinal rod bipolar and AII amacrine cells. The Journal of Physiological Sciences 64, Supplement 1, S143 (2014)
  
  第37回日本神経科学大会
  金子優子，青葉（藤牧）香代，渡辺修一．ドパミン作動性アマクリン細胞に発現する電位依存性Naチャネル.
  
  2013年
  第36回日本分子生物学会年会
  金子優子，青葉（藤牧）香代，渡辺修一．Expression pattern of voltage-gated sodium channel subtypes in AII- and dopaminergic amacrine cells in the rat retina.
  
  第90回日本生理学会大会
  金子優子，渡辺修一．ラット網膜に発現する電位依存性ナトリウムチャネル．
  
  2012年
  第１６回視覚科学フォーラム
  田丸文信、戸塚博子、渡辺修一. 杆体入力型双極細胞からAIIアマクリン細胞へのグルタミン酸放出の制御：温度依存性TRPM1チャネルの関与？
  
  第89回日本生理学会大会
  金子優子，渡辺修一．ドーパミン放出型アマクリン細胞に発現する電位依存性Naチャネルαサブユニットのサブタイプ．
  
  2011年
  第34回日本神経科学学会
  Fuminobu Tamalu, Shu-Ichi Watanabe, Robert Barlow. Functional roles of TRPM1 channels in the synaptic transmission between rod bipolar and AII amacrine cells in the mouse retina. Neuroscience Research 71,Supplement, e256 (2011)
  
  第15回視覚科学フォーラム
  金子優子、渡辺修一
  ドパミン作動性アマクリン細胞にはどの電位依存性Naチャネルサブタイプが発現しているのか
  
  2010年
  第234回生理学東京談話会 シンポジウム「網膜の情報処理」
  田丸文信
  桿体経路における網膜AIIアマクリン細胞の情報処理機構
  
  第33回日本神経科学学会(Neuro2010)
  Fuminobu Tamalu, Yumiko Umino, Yuning Sun, Eduardo Solessio, Shu-Ichi
  Watanabe, Robert Barlow. Response of retinal rod bipolar cells in chronically hypoglycemic mice. Neuroscience Research 68,Supplement1, e268 (2010)
  
  第14回視覚科学フォーラム
  田丸文信、海野由美子、Drew Everhart、Yuning Sun、Eduardo Solessio、渡辺修一、
  The Late Robert Barlow Jr
  慢性低血糖マウスの月齢依存的視覚低下の原因の１つは桿体入力型双極細胞の応答低下
  である
  
  FASEB Summer Research Conferences (Retinal Neurobiology and Visual Processing)
  Yuko Kaneko, Shu-Ichi Watanabe. NaV1.2 and NaV1.6 were expressed in dopaminergic amacrine cells in the rat retina.
  
  第87回日本生理学会大会
  Yuko Kaneko, Shu-Ichi Watanabe. Voltage-gated sodium channel subtypes expressed in dopaminergic amacrine cells in the rat retina. The Journal of Physiological Sciences 60, Supplement, S136 (2010)
  
  2009年
  39th Annual Meeting of Society for Neuroscience 2009（第39回北米神経科学会）（Chicago, USA）Fuminobu Tamalu, Shu-Ichi Watanabe. Body temperature optimizes the synaptic transmission from retinal rod bipolar cells to AII amacrince cells.
  
  第13回視覚科学フォーラム
  田丸文信、渡辺修一
  桿体入力型双極細胞からAIIアマクリン細胞へのグルタミン酸放出は温度依存性である
  
  第32回日本神経科学学会
  Yuko Kaneko, Shu-Ichi Watanabe. Voltage-gated sodium channel subtypes expreesed in the inner nuclear layer of the rat retina. Neuroscience Research 65,Supplement, S171 (2009)
  
  36th International Congress of Physiological Sciences(IUPS2009,第86回日本生理学会大会)
  Fuminobu Tamalu, Shu-Ichi Watanabe.Optimizatio of the synaptic transmission by body temperature in the mouse retina. The Journal of Physiological Sciences 59,Supplement1,p139 (2009)
  
  36th International Congress of Physiological Sciences(IUPS2009,第86回日本生理学会大会)
  Yuko Kaneko, Shu-Ichi Watanabe. Expression pattern of voltage-gated sodium channel subtypes in retinal amacrine cells of the rat retina. The Journal of Physiological Sciences 59,Supplement, 250 (2009)
  
  （その他）
  2009年
  田丸文信（2009）「IUPS 2009 Whole-day symposium “Processing and integration of sensory　information”と感覚合同グループディナー“Sensory Physiology Social Dinner”に参加して」（日本神経科学学会　神経科学ニュース　No.5（通巻177）p.18-20